通过恶性周围神经鞘肿瘤细胞中絮状等位基因的 离体 消融来定义肿瘤发生的基因功能

该协议提供了一种替代的体内方法来研究胚胎致死基因敲除的肿瘤生长作用。这种方法的优点是，通常胚胎致命的基因敲除可以在来自基因工程小鼠模型的肿瘤中进行，以研究它们在体内的功能丧失效应。该技术可应用于需要研究传统基因敲除小鼠模型中无法实现的胚胎必需基因的体内作用的疾病。

生成动物模型需要时间，并且需要进行经验测试以确定腺病毒感染的最佳MOI，以确保实现适当的重组。首先，用所需的基因型识别小鼠。当荷瘤小鼠达到其人道终点时，对小鼠实施安乐死，并使用无菌手术刀切除肿瘤。

使用手术刀将肿瘤解剖成面包式切口的三个部分，以产生用于福尔马林固定石蜡包埋的组织片段，早期传代培养生成和快速冷冻以进行分析分析。用苏木精和曙红对 5 微米厚的福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片进行染色。一旦病理学家确认肿瘤，进行免疫组织化学染色以确认肿瘤诊断。

将新鲜收集的恶性周围神经鞘肿瘤组织置于冰上冰冷的无菌PBS中，然后将其转移到无菌工作区以建立早期传代培养物。将肿瘤组织切碎成2至4毫米的碎片，并在含有10毫升生长培养基的10平方厘米处理的组织培养皿中研磨8至10次。将这些组织培养在高糖DMEM-10生长培养基中，其中补充有10个纳摩尔神经肽-1β和2个微摩尔毛喉素。

将早期传代的肿瘤细胞以1.5倍的密度接种至第六细胞，每10平方厘米处理过含有DMEM-10生长培养基的10平方厘米的组织培养皿。12至16小时后，用2至4毫升DPBS洗涤贴壁培养物，并在10毫升无血清DMEM中以每细胞约400个斑块形成单位感染细胞。感染48小时后，在荧光显微镜上短暂检查细胞的EGFP信号，以确保有效感染约50%至100%阳性细胞，然后FACS对EGFP阳性感染细胞进行分类。

FACS分选后，让细胞在组织培养箱中恢复至少24至48小时，然后准备细胞进行基于体外细胞的分析或体内移植。通过使用从部分分选的EGFP阳性细胞中分离的基因组DNA进行PCR来确认Erbb4缺失。在接下来的七天内，使用基于图像的自动细胞仪对接种在96孔板中的分选肿瘤细胞进行增殖测定。

用钩子和碘化丙啶染料染色细胞，并使用自动读板器捕获细胞的图像，以计数每个孔中活细胞和死细胞的数量。使用标准酸性胍酚和氯仿方法从分选的肿瘤细胞中分离总RNA。打开软件，使用默认设置按照程序特定的步骤执行RNA序列比对。

选择分析方法，寻找RNA，然后选择小鼠参考基因组。上传 BED 文件（如果排序内核提供）。上载 FASTQ 排序文件并为这些文件分配唯一的复制名称。

组复制 FASTQ 文件，并将这些文件指定为复制集。为了进行统计和归一化分析，以识别具有强大统计能力的差异基因表达信号，打开分析软件并选择GFP FASTQ文件作为对照数据集。接下来，选择 DESeq2 作为统计和归一化方法，然后开始组装和分析。

使用集成到开放获取功能富集分析工具中的基因本体数据集，对已鉴定的具有统计学意义的Erbb4介导的DEG进行功能富集分析，以确定Erbb4基因丢失的生物学和通路意义。将肿瘤细胞注射到麻醉小鼠的坐骨神经中，以评估感染后细胞中的体内同种异体移植物生长潜力。一旦肿瘤达到所需的大小，如前所述，将肿瘤从安乐死小鼠中解剖为两到三个部分。

将一个组织切片固定在4%多聚甲醛中过夜，然后将固定切片包埋在石蜡中。从FFPE组织制作五微米厚的切片后，将切片安装在载玻片上，并使用H&E和免疫染色确认移植组织中是否存在肿瘤细胞，如前所述。为了确认两种实验条件之间的体内Erbb4表达差异，用Erbb4特异性抗体染色福尔马林固定的石蜡包埋组织。

分析了恶性周围神经鞘肿瘤组织细胞与腺病毒的转导。使用荧光显微镜检测EGFP表达细胞，并使用相差显微镜测定细胞总数。在Cre介导的基因消融后，根据转染效率，与对照转导相比，PCR基因分型显示出完全的基因敲除和诱导和未引出的细胞的异质群体。

在恶性周围神经鞘肿瘤组织的原位同种异体移植物中发现的特征性组织病理学与来自原始基因工程动物模型的肿瘤相比，显示出细胞形态的差异。Erbb4消融降低了腺5-CMV-克雷消融细胞中的细胞密度和细胞增殖，控制腺5-CMV-GFP转导细胞。与对照腺5-CMV-EGFP治疗的同种异体移植肿瘤相比，腺5-CMV-Cre转导的同种异体移植物的结果导致用腺5-CMV-Cre转导的肿瘤细胞中Erbb4的表达减少。

通过对照腺5-CMV-Cre-转导细胞的免疫反应性检测评估血管密度，代表性结果显示，与对照腺5-CMV-EGFP转导细胞相比，腺5-CMV-Cre-转导细胞的同种异体移植物的血管密度显着降低。基因消融后，细胞可用于许多不同类型的基于细胞的测定，例如增殖，迁移，3D生长或微环境改变，以及体内原位注射。