用于宿主靶向治疗结核病临床前检测的自动化培养系统

该协议的主要优点是，它比计数集落形成单位以估计结核分枝杆菌细胞内生长的传统方法劳动强度和耗时更少。这种技术使研究人员更容易快速筛选FDA批准的药物，目的是将它们重新用作治疗结核病的宿主定向疗法。该方法非常简单明了。

分枝杆菌和EO载体T细胞培养技术的基本知识足以逐步遵循方案。首先，将6至8毫升减毒分枝杆菌培养物H37Ra从T25烧瓶转移到15毫升聚丙烯管中。在台式离心机中离心管。

小心地取出管子后，将管子转移到生物安全柜中，等待一分钟让细菌沉淀。将上清液倒入消毒剂丢弃容器中。然后，盖上试管，轻轻敲击试管的侧面，让细菌沉淀一分钟，将细菌悬浮在剩余的培养基中。

加入并混合两毫升预热的完全RPMI，并转移到50毫升锥形管中。要重悬分枝杆菌，请将悬浮液吸入配备25号针头的5毫升注射器中。然后，非常轻柔地沿着管的侧壁喷射，以尽量减少气溶胶的产生，并重复该过程六到八次。

将针头和注射器丢弃在生物安全柜的锐器容器中。将悬浮液转移到两毫升的微量离心管中，然后离心以沉淀任何剩余的团块。将管子放回安全柜，让细菌沉淀一分钟。

将上部1至1.5毫升上清液转移到新管中。将原始管丢弃在装有消毒剂的废物桶中。充分混合并将不同量的分枝杆菌悬浮液添加到两个孔玻璃室载玻片中，并将载玻片在37摄氏度下孵育三小时。

上下移液三次以去除非吞噬细菌后，从玻璃室载玻片中取出培养基。用两毫升PBS清洗一次。解冻储存在零下20摄氏度的PBS中4%PFA的等分试样。

将等分试样稀释至2%PFA，并向每个孔中加入两毫升。在室温下孵育10分钟后，从安全柜中取出载玻片进行染色。将PFA丢弃在PFA化学废物容器中，然后在温和的自来水中清洗载玻片。

使用塑料移液管，分配足够的金胺以覆盖载玻片上的细胞，并在室温下在黑暗中孵育载玻片一分钟。用自来水洗掉载玻片上多余的染料，并在黑暗中加入淬火剂一分钟。洗掉多余的淬灭剂后，在室温下用Hoechst染色剂在黑暗中孵育15分钟。

然后洗掉赫斯特污渍。排出多余的水分后，添加一滴防褪色剂和盖玻片。使用100倍油物镜在荧光显微镜下检查风干载玻片。

分枝杆菌在菲茨滤光片下会发出绿色荧光，细胞核在DAPI滤光片下会发出蓝色荧光。计算每个细胞吞噬的分枝杆菌数量和感染细胞的百分比以确定MOI。根据板中孔的表面积计算达到所需MOI所需的分枝杆菌悬浮液体积。

混合分枝杆菌悬浮液后，将计算的体积添加到12孔板上的细胞中，以达到所需的MOI。将板在37摄氏度下孵育三小时，以使分枝杆菌被吞噬。然后用温热的RPMI多次洗涤孔来去除细胞外细菌。

加入500微升裂解缓冲液10分钟，以裂解三小时样品的一个孔中的巨噬细胞，并收集裂解物以确定基线感染率。然后将新鲜的完全RPMI和所需的药物剂量或载体对照添加到剩余的孔中。根据实验设计，将板在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育一到八天。

为了确定三小时样品的初始接种物的阳性时间百分比或TTP，将Middlebrook肉汤和仪器培养瓶加热至室温。将培养基从12孔板转移到相应的标记锥形管中，并向每个孔中加入500微升无菌裂解缓冲液。10分钟后，用无菌刮刀轻轻地从孔中刮出细胞，并将它们与适当的锥形管中的培养基混合。

一旦用0.5毫升无菌PBS洗涤孔并与培养基和裂解物结合，通过轻轻地将每个样品通过25号针头注射器六到八次来打破团块。通过将900微升MB肉汤加入100微升样品中，将样品稀释在MB肉汤中，并在孵育期间所需的时间点重复收获过程。用70%酒精对橡胶盖进行消毒来准备仪表盘瓶。

将所有样品的足够营养补充剂转移到锥形管中，并使用针头和注射器将0.5毫升营养补充剂注入仪器培养瓶中。然后，将500微升1/10稀释的样品移入1毫升V底管中。使用针头和注射器将500微升样品注入指定的仪器培养瓶中。

小心地将瓶子从生物安全柜运输到仪器进行装载后，按下自动微生物检测系统上的“装载”按钮。扫描仪器培养瓶上的条形码，并将瓶子放入37摄氏度的检测系统培养箱中长达42天。从仪器屏幕上读取并记录达到阳性所需的时间，并计算百分比TTP。

TTP 阳性提示分枝杆菌生长。自动液体培养仪器每 10 分钟监测一次二氧化碳水平并计算 TTP，即从接种到培养物被标记为阳性的天数。说明了初始接种物中 TTP 与 CFU 的 log（10） 值之间的反比关系。

当将通过计数CFU测定的巨噬细胞内结核分枝杆菌的细胞内生长与描述的自动培养方法进行比较时，结果之间存在显着相关性。通过将巨噬细胞感染后长达8天的TTB值与初始TTP值进行比较，以图形方式呈现结核分枝杆菌的生长。CFU和液体培养之间的类似趋势表明，在溶液中的全反式维甲酸或AtRA或包封在PLGA微粒中的等效剂量的AtRA存在下，巨噬细胞中结核分枝杆菌的生长受到显着抑制。

在感染的THP-1细胞中进行剂量反应实验，以确定单独使用抗生素利奈唑胺或利奈唑胺和干扰素γ的组合的疗效。药物之间未观察到显着的相互作用。AFP染色允许我们使用低MOI来最大限度地减少感染巨噬细胞时的细胞死亡，并确保无论使用何种处理都使用相同的MOI。

按照该协议，可以鉴定和进一步研究先导抗结核药物，以研究其体内疗效。