このプロトコルの主な利点は、結核菌の細胞内増殖を推定するためにコロニー形成単位をカウントする従来の方法よりも労働集約的で時間がかからないことです。この技術により、研究者は、結核を治療するための宿主主導療法として再利用することを目的として、FDA承認薬を迅速にスクリーニングすることが容易になります。方法は非常にシンプルで簡単です。
マイコバクテリアおよびEOキャリアT細胞培養技術に関する基本的な知識は、プロトコルを段階的に従うのに十分です。はじめに、6〜8ミリリットルの弱毒化マイコバクテリア培養物H37RaをT25フラスコから15ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。ベンチトップ遠心分離機でチューブを遠心分離します。
チューブを慎重に取り外した後、チューブを生物学的安全キャビネットに移し、細菌が定着するまで1分間待ちます。上清を消毒剤廃棄容器に注ぎます。次に、チューブをキャップし、チューブの側面を軽くたたいて残りの培地に細菌を懸濁させ、細菌を1分間沈降させます。
2ミリリットルの予熱した完全なRPMIを加えて混合し、50ミリリットルの円錐形のチューブに移します。マイコバクテリアを再懸濁するには、25ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器に懸濁液を吸い込みます。次に、エアロゾルの生成を最小限に抑えるためにチューブの側壁を非常に穏やかに排出し、このプロセスを6〜8回繰り返します。
針とシリンジは、バイオセーフティキャビネット内の鋭利な容器に廃棄してください。懸濁液を2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、遠心分離機で残りの塊をペレット化します。チューブを安全キャビネットに戻し、バクテリアを1分間沈降させます。
上清の上部1〜1.5ミリリットルを新しいチューブに移します。消毒剤が入っている廃棄物バケツの元のチューブを廃棄します。よく混合し、2つのウェルガラスチャンバースライドに様々な量のマイコバクテリア懸濁液を加え、そして37°Cで3時間スライドをインキュベートする。
非食作用細菌を除去するために上下に3回ピペッティングした後、ガラスチャンバースライドから培地を取り出します。2ミリリットルのPBSで1回洗浄します。マイナス20°Cで保存したPBS中の4%PFAのアリコートを解凍します。
アリコートを2%PFAに希釈し、各ウェルに2ミリリットルを加えます。室温で10分間インキュベートした後、染色のために安全キャビネットからスライドを取り外します。PFA化学廃棄物容器にPFAを廃棄し、穏やかな水道水でスライドを洗います。
プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、スライド上の細胞を覆うのに十分なオーラミンを分注し、暗所で室温で1分間スライドをインキュベートします。スライドから余分な染料を水道水で洗い流し、暗所で1分間クエンチャーを加えます。余分なクエンチャーを洗い流した後、暗所でヘキスト染色を加えて室温で15分間インキュベートします。
その後、ヘキストの汚れを洗い流します。そして余分な水を排出した後、一滴の退色防止とカバースリップを追加します。100倍オイル対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡下で風乾スライドを調べます。
マイコバクテリアはフィッツフィルター下で緑色に蛍光を発し、核はDAPIフィルター下で青色に蛍光を発します。細胞あたりの貪食されたマイコバクテリアの数と感染細胞の割合を数えて、MOIを決定します。プレート内のウェルの表面積に基づいて、必要なMOIを達成するために必要なマイコバクテリア懸濁液の量を計算します。
マイコバクテリア懸濁液を混合した後、計算された体積を12ウェルプレート上の細胞に加えて、所望のMOIを達成する。プレートを摂氏37度で3時間インキュベートして、マイコバクテリアを食作用させます。次に、ウェルを温かいRPMIで数回洗浄して細胞外細菌を取り除きます。
500マイクロリットルの溶解バッファーを10分間添加して、3時間サンプルの1ウェルでマクロファージを溶解し、ライセートを収集してベースライン感染率を決定します。次に、新鮮な完全なRPMIと必要な薬物用量、またはビヒクルコントロールを残りのウェルに追加します。実験デザインに応じて、二酸化炭素インキュベーター内のプレートを摂氏37度で1〜8日間インキュベートします。
3時間サンプルの初期接種材料の陽性になるまでの時間(TTP)の百分率を決定するために、ミドルブルックブロスおよび器具培養ボトルを室温に温めた。培地を12ウェルプレートから対応する標識コニカルチューブに移し、各ウェルに500マイクロリットルの滅菌溶解バッファーを加えます。10分後、滅菌スクレーパーでウェルから細胞を静かにこすり落とし、適切な円錐管内の培地と混ぜ合わせます。
ウェルを0.5ミリリットルの滅菌PBSで洗浄し、培地およびライセートと合わせたら、各サンプルを25ゲージのニードルシリンジに6〜8回静かに通して塊を破ります。100マイクロリットルのサンプルに900マイクロリットルのMBブロスを加えてサンプルをMBブロスで希釈し、インキュベーション中の必要な時点で回収プロセスを繰り返します。インストルメント クラスター ボトルを準備し、ゴム製キャップを 70% アルコールで滅菌します。
すべてのサンプルに十分な栄養補助食品を円錐形のチューブに移し、針と注射器を使用して0.5ミリリットルの栄養補助食品を器具培養ボトルに注入します。次いで、1ミリリットルのv底チューブに10分の1希釈サンプルの500マイクロリットルをピペットで入れる。針とシリンジを使用して、500マイクロリットルのサンプルを割り当てられた機器培養ボトルに注入します。
ボトルをバイオセーフティキャビネットから機器に慎重に輸送して積み込んだ後、自動微生物検出システムの「積み込み」ボタンを押します。機器培養ボトルのバーコードをスキャンし、ボトルを摂氏37度で検出システムインキュベーターに最大42日間入れます。機器の画面から陽性に達するのにかかった時間を読み取って記録し、TTPの割合を計算します。
陽性のTTPはマイコバクテリアの増殖を示します。自動液体培養装置は、10分ごとに二酸化炭素レベルを監視し、接種から培養物が陽性としてフラグが立てられるまでの日数であるTTPを計算しました。TTPと初期接種材料におけるCFUのlog(10)値との逆の関係を示した。
CFUを列挙して測定したマクロファージ内の結核菌群の細胞内増殖を、記載の自動培養法と比較したところ、結果との間に有意な相関が得られた。結核菌の増殖は、マクロファージの感染後最大8日間のTTB値を初期TTP値と比較することによりグラフで提示した。CFUと液体培養の間の同様の傾向は、溶液中のオールトランスレチノイン酸(AtRA)の存在下で、またはPLGA微粒子にカプセル化されたAtRAの等量の存在下で、マクロファージにおける結核菌の増殖の有意な阻害を示しました。
抗生物質リネゾリド単独、またはリネゾリドとインターフェロンガンマの組み合わせの有効性を決定するために、感染したTHP-1細胞で用量反応実験を行った。薬物間に有意な相互作用は観察されなかった。AFP染色により、低MOIを使用してマクロファージに感染する際の細胞死を最小限に抑え、使用する処理に関係なく同じMOIを確実に使用できます。
このプロトコルに従って、鉛抗結核薬を特定し、さらに研究して、in vivoの有効性を調査することができます。
