Le principal avantage de ce protocole est qu’il exige moins de main-d’œuvre et prend moins de temps que la méthode traditionnelle de comptage des unités formant colonie pour estimer la croissance intracellulaire de Mycobacterium tuberculosis. Cette technique permet aux chercheurs de dépister rapidement les médicaments approuvés par la FDA dans le but de les réorienter en thérapies dirigées par l’hôte pour traiter la tuberculose. La méthode est très simple et directe.
Une connaissance de base des techniques de culture de cellules T porteuses mycobactériennes et OE serait suffisante pour suivre le protocole étape par étape. Pour commencer, transférer six à huit millilitres de culture mycobactérienne atténuée H37Ra du ballon T25 dans un tube en polypropylène de 15 millilitres. Centrifuger le tube dans une centrifugeuse de paillasse.
Après avoir soigneusement retiré le tube, transférez-le dans l’enceinte de sécurité biologique et attendez une minute que les bactéries se déposent. Verser le surnageant dans le récipient à désinfecter mis au rebut. Ensuite, reboucher le tube et suspendre les bactéries dans le milieu restant en tapotant doucement le côté du tube et en permettant aux bactéries de s’installer pendant une minute.
Ajouter et mélanger deux millilitres de RPMI complet préchauffé et transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Pour remettre les mycobactéries en suspension, aspirez la suspension dans une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 25. Ensuite, éjectez très doucement le long de la paroi latérale du tube pour minimiser la production d’aérosols, et répétez le processus six à huit fois.
Jetez l’aiguille et la seringue dans un contenant pour objets tranchants et tranchants dans l’enceinte de biosécurité. Transférer la suspension dans un tube microcentrifuge de deux millilitres et centrifuger pour enduire les touffes restantes. Remettez le tube dans l’enceinte de sécurité et laissez les bactéries s’installer pendant une minute.
Transférer les 1 à 1,5 millilitres supérieurs du surnageant dans un nouveau tube. Jetez le tube d’origine dans le seau à déchets contenant le désinfectant. Bien mélanger et ajouter différentes quantités de suspension mycobactérienne aux deux lames de chambre en verre de puits, et incuber les lames pendant trois heures à 37 degrés Celsius.
Après avoir pipeté de haut en bas trois fois pour déloger les bactéries non phagocytées, retirez le milieu de la lame de chambre en verre. Lavez une fois avec deux millilitres de PBS. Décongeler les aliquotes de 4 %PFA dans le PBS stockées à moins 20 degrés Celsius.
Diluer l’aliquote à 2% PFA et ajouter deux millilitres à chaque puits. Après avoir incubé pendant 10 minutes à température ambiante, retirez la lame de l’armoire de sécurité pour la tacher. Jetez le PFA dans le contenant de déchets chimiques PFA et lavez la lame sous un léger jet d’eau du robinet.
À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, distribuer suffisamment d’auramine pour couvrir les cellules de la lame et incuber la lame pendant une minute à température ambiante dans l’obscurité. Lavez l’excès de colorant de la lame avec de l’eau du robinet et ajoutez le désinfectant pendant une minute dans l’obscurité. Après avoir lavé l’excès de désarmant, incuber pendant 15 minutes à température ambiante avec la tache Hoechst dans l’obscurité.
Ensuite, lavez la tache Hoechst. Et après avoir drainé l’excès d’eau, ajoutez une goutte d’antidécoloration et un bordereau de couverture. Examinez la lame séchée à l’air sous le microscope fluorescent à l’aide de l’objectif d’huile 100x.
Les mycobactéries vont fluorescence verte sous le filtre Fitz et les noyaux vont fluorescent bleu sous le filtre DAPI. Compter le nombre de mycobactéries phagocytées par cellule et le pourcentage de cellules infectées pour déterminer l’MOI. Calculer le volume de suspension mycobactérienne nécessaire pour obtenir l’MOI requis en fonction de la surface d’un puits dans la plaque.
Après avoir mélangé la suspension de mycobactéries, ajoutez le volume calculé aux cellules sur 12 plaques de puits pour obtenir la MOI souhaitée. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures pour permettre aux mycobactéries d’être phagocytées. Ensuite, éliminez les bactéries extracellulaires en lavant les puits avec un RPMI chaud plusieurs fois.
Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse pendant 10 minutes pour lyser les macrophages dans un puits de l’échantillon de trois heures, et recueillir le lysat pour déterminer le taux d’infection de base. Ajoutez ensuite un nouvel indice RPMI complet et les doses de médicaments requises, ou le contrôle du véhicule, aux puits restants. Incuber les plaques dans l’incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant un à huit jours, selon la conception de l’expérience.
Pour déterminer le pourcentage de temps jusqu’à la positivité, ou PTT, de l’inoculum initial de l’échantillon de trois heures, réchauffer le bouillon Middlebrook et les bouteilles de culture instrumentale à température ambiante. Transférer le milieu de la plaque de 12 puits vers les tubes coniques marqués correspondants et ajouter 500 microlitres de tampon de lyse stérile à chaque puits. Après 10 minutes, grattez doucement les cellules du puits avec un grattoir stérile et combinez-les avec le milieu dans le tube conique approprié.
Une fois le puits lavé avec 0,5 millilitre de PBS stérile et combiné avec le milieu et le lysat, briser les touffes en passant doucement chaque échantillon dans une seringue à aiguille de calibre 25 six à huit fois. Diluer l’échantillon dans du bouillon MB en ajoutant 900 microlitres de bouillon MB à 100 microlitres d’échantillon, et répéter le processus de récolte aux moments requis pendant l’incubation. Préparez les flacons du combiné d’instruments en stérilisant le bouchon en caoutchouc avec de l’alcool à 70%.
Transférez suffisamment de suppléments nutritifs pour tous les échantillons dans un tube conique et utilisez une aiguille et une seringue pour injecter 0,5 millilitre de supplément nutritif dans le flacon de culture instrumentale. Ensuite, pipeter 500 microlitres de l’échantillon dilué un sur 10 dans un tube à fond en V d’un millilitre. Utilisez une aiguille et une seringue pour injecter les 500 microlitres d’échantillon dans les flacons de culture d’instruments assignés.
Après avoir soigneusement transporté les bouteilles de l’armoire de biosécurité à l’instrument pour le chargement, appuyez sur le bouton de chargement du système automatisé de détection microbienne. Scannez les codes-barres sur les bouteilles de culture instrumentale et placez les bouteilles dans l’incubateur du système de détection à 37 degrés Celsius pendant 42 jours. Lire et enregistrer le temps nécessaire pour atteindre la positivité à partir de l’écran de l’instrument et calculer le pourcentage TTP.
Un PTT positif indique une croissance mycobactérienne. L’instrument automatisé de culture liquide surveillait les niveaux de dioxyde de carbone toutes les 10 minutes et calculait le PTT, qui est le nombre de jours entre l’inoculation et le moment où les cultures sont signalées comme positives. Une relation inverse entre le TTP et les valeurs log(10) de l’UFC dans l’inoculum initial a été illustrée.
Lorsque la croissance intracellulaire de Mycobacterium tuberculosis dans les macrophages déterminée par le dénombrement de l’UFC a été comparée à la méthode de culture automatisée décrite, une corrélation significative entre les résultats a été obtenue. La croissance de Mycobacterium tuberculosis a été présentée graphiquement en comparant les valeurs TTB jusqu’à huit jours après l’infection des macrophages à la valeur initiale de TTP. Une tendance similaire entre l’UFC et la culture liquide a démontré une inhibition significative de la croissance de Mycobacterium tuberculosis dans les macrophages en présence d’acide rétinoïque tout-trans, ou AtRA, en solution, ou de la dose équivalente d’AtRA encapsulée dans des microparticules PLGA.
Une expérience dose-réponse a été réalisée sur des cellules THP-1 infectées pour déterminer l’efficacité de l’antibiotique linézolide seul, ou de la combinaison de linézolide et d’interféron gamma. Aucune interaction significative n’a été observée entre les médicaments. La coloration AFP nous permet d’utiliser un faible MOI pour minimiser la mort cellulaire lors de l’infection des macrophages et pour nous assurer que le même MOI est utilisé quel que soit le traitement utilisé.
En suivant ce protocole, les principaux médicaments antituberculeux peuvent être identifiés et étudiés plus avant pour étudier leur efficacité in vivo.
