Este protocolo es significativo porque demuestra, cómo preparar nanopartículas poliméricas, ácidos nucleicos encapsulados en un simple paso. Las principales ventajas de esta técnica, son la versatilidad, ya que se puede aplicar a diferentes ácidos nucleicos y tipos celulares. El uso de procedimientos simples para la preparación de partículas, como el pipeteo hacia arriba y hacia abajo, y la posibilidad de extender la estabilidad de las nanopartículas y las condiciones del tambor mediante la liofilización.
Demostrando el procedimiento estarán Laura Olmo, Coral García-Fernández, María Stampa López-Pinto y María Navalón-López, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio y Marta Díaz-Caballero, postdoctorado de nuestro laboratorio. Para la formación de poliplexos, descongele los polímeros previamente preparados, el péptido C6, los ésteres poli beta amino y el vórtice de la solución. Después de pipetear la mezcla de polímero hacia arriba y hacia abajo, prepare una solución de 12.5 milimolares en acetato de sodio.
Vórtice la solución y espere 10 minutos. A continuación, prepare el ARNm a 0,5 miligramos por mililitro y mezcle mediante pipeteo. Vuelva a envúcer la solución de polímero, luego mezcle la solución de material genético en la solución de polímero en una proporción de uno a uno en un tubo de micro centrífuga e incube el tubo a 25 grados Celsius durante 30 minutos en un termobloque.
Después de la incubación, precipitar la mezcla con una o dos RNasa de agua libre agregando la muestra a un tubo de micro centrífuga que contiene el agua, luego para incluir los excipientes, agregue un montón de 20 milimolares y una solución de sacarosa al 4% en el mismo volumen que la mezcla de ARNm y ésteres de poli beta amino, y mezcle mediante pipeteo. Para la liofilización después de congelar la solución de poliplex a menos 80 grados Celsius durante una hora, realice el secado primario, luego almacene inmediatamente los poliplexos a menos 20 grados Celsius para evitar la rehidratación. Para la resuspensión poliplex, retire las nanopartículas liofilizadas del congelador de menos 20 grados Celsius y agregue rápidamente la cantidad correspondiente de agua hidrogenada profunda para volver a dispersar el sólido y lograr la concentración deseada.
Pipetear suavemente hasta la resuspensión total y una vez disuelto, pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente evitando burbujas. Después de 24 horas de transfección para evaluación cualitativa por microscopía de fluorescencia, coloque la placa de 96 pocillos que contiene las células Hela transfectadas en el microscopio y comience a visualizar utilizando el objetivo de 10 veces. Primero, aplique un balance de blancos para crear una referencia de fondo para el software, luego adquiera una imagen para superponerla con la imagen de fluorescencia durante el análisis.
Cambie el modo de microscopio al modo de reflexión y mueva la rueda del filtro al láser azul para visualizar EGFP. Luego adquiera imágenes para todas las condiciones o pozos que emplean el mismo tiempo de exposición. Para la evaluación cuantitativa por citometría de flujo, lave las células Hela transfectadas en una placa de 96 pocillos utilizando 100 microlitros de PBS por pozo.
Después de aspirar el PBS a 25 microlitros de tripsina por pozo e incubar a 37 grados Centígrados durante cinco minutos. Una vez que las células se desprenden, agregue los medios previamente recuperados para inactivar la tripsina, luego fije las células agregando 31.25 microlitros de 10% de formalina por pozo e incubando durante 20 minutos. A continuación, encienda el citómetro de flujo y el software, luego configure las condiciones adecuadas para el experimento, incluido el tipo de volumen de muestra de placa y otros parámetros como agitar y enjuagar entre muestras.
Configure los parámetros apropiados para cuantificar el porcentaje de células transfectadas positivamente viendo primero los datos de flujo en la luz dispersa hacia adelante frente a la luz dispersa lateral para distinguir las células de los escombros. Y luego trazar otro diagrama de dispersión, comparando la amplitud versus la altura para cerrar y discriminar las celdas individuales. Un día antes de la transfección, placa 10, 000 células JAWS II por pozo en una placa de 96 pocillos para incubación durante la noche.
Al día siguiente transfecta las células con 0,6 microgramos de ARNm por pozo e incuba la placa durante 24 horas en una incubadora de aire seco a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, lave las células que quedan en el pozo con 25 microlitros de PBS. Después de aspirar el PBS a 25 microlitros de tripsina e incubar la placa durante cinco minutos a 37 grados centígrados para separar las células.
Detenga la reacción de tripsina agregando los medios previamente recuperados al pozo correspondiente. Luego centrifugue la placa, aspire el medio y fije las células agregando 50 microlitros de PBS y 2.5% de formalina por pozo, seguido de incubar la placa a cuatro grados Celsius durante 20 minutos, centrifugue la placa. Luego agregue 50 microlitros de PBS y 3% BSA por pozo e incubadora durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, centrifugue la placa nuevamente, luego agregue 50 microlitros del anticuerpo de ovoalbúmina de ratón en PBS y 3% BSA e incubadora durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Repita el paso de centrifugación, luego lave las células con 50 microlitros de PBS. Después de aspirar el PBS, agregue los anticuerpos secundarios e incube durante una hora a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, repita los pasos de centrifugación y lavado. Luego resuspende las células y 100 microlitros de PBS y 2.5% de formalina para el análisis de citometría de flujo. La caracterización fisicoquímica de nanopartículas encapsulantes de ARNm GFP fresco y liofilizado no muestra diferencias significativas en el tamaño y el índice de polidispersión.
La microscopía electrónica de transmisión de los poliplexos confirma la formación de nanopartículas esféricas y mono dispersas de aproximadamente 50 nanómetros de diámetro. Los datos de eficiencia de encapsulación de un péptido de Lego y poliplexos poli beta amino éster modificados que encapsulan GFP u ovoalbúmina no muestran diferencias significativas según el tipo de ARNm. Aquí se muestra un análisis cualitativo de la expresión de EGFP, 24 horas después de la transacción en la línea celular JAWS II.
Cuantitativamente comparado con el control negativo. El porcentaje de células GFP positivas es significativamente mayor y comparable a un control positivo realizado con un reactivo de transfección clásico. El oligopéptido cargado de ARNm de ovoalbúmina y las nanopartículas modificadas de poli beta amino éster pueden activar las células dendríticas como se ve por la expresión significativamente mayor de marcadores de membrana CD11b y CD86 en células transfectadas en comparación con células no transfectadas.
Nuestra plataforma de vacunación basada en el uso de ARNm como principio activo, así como nuestros polímeros patentados se pueden adaptar para ser utilizados en profilaxis, así como para la terapéutica del cáncer. Podemos utilizar nuestra tecnología para destacar esa contribución en la inmunoterapia contra el cáncer. ya que podemos encapsular antígenos asociados a tumores en nuestras nanopartículas y hacer un cambio en los tratamientos contra el cáncer.
