向您描述的MEA 4-AP脊柱切片准备提供了一个平台来研究背角电路的连接性以及这些网络在脊柱感觉处理过程中如何相互作用。所提出的方法使得背角回路活动能够在宏观区域分辨率水平上进行研究。该制剂可用作快速筛选工具，以评估化合物破坏脊髓感觉回路中信号传导的能力。
这种方法有助于弥合我们对特定细胞类型和小微电路的活动如何影响大量神经元的了解的差距，从而随后塑造背角行为反应的输出，并最终塑造疼痛体验。首先，用马血清填充MEA孔30分钟。去除精华素后，用蒸馏水彻底冲洗MEA五次，直到蒸馏水变得无泡沫。
然后，用人工脑脊液填充孔。将麻醉的小鼠斩首后，通过在臀部水平处的皮肤上做一个小切口来去除腹部区域的皮肤。然后，将切口两侧的皮肤拉扯到腹侧和背部，直到所有皮肤从肋骨笼的顶部移动到骨盆的顶部。
将身体放在冰上后，使用腹侧方法通过去除内脏并横向切割肋骨到胸骨来暴露脊柱。切除腹肋骨笼，肩胛骨，下肢和骨盆。将椎体柱和肋骨制剂转移到含有冰冷蔗糖人造脑脊液的解剖浴中。
通过将销钉穿过下背部肌肉和连接的上肋骨来固定准备工作的所有四个角。用颚骨切除覆盖椎骨腹侧表面的所有肌肉和结缔组织，并识别腰骶骨肿大上方的椎体区域，其位于T12-L2椎体的正下方。将椎体尾部切除至腰骶部扩大区域，以进入位于椎管上的脊髓。
使用弯曲的弹簧剪刀，双侧切开椎骨蒂，同时抬起并拉动椎体，以分离椎骨的腹侧和背侧并暴露脊髓。一旦椎体被移除以露出腰骶骨肿大，请小心地用弹簧剪刀清除锚定脊髓的剩余根部，直到脊髓漂浮自由。用腰骶骨肿大上方和下方的喙骨和尾部切口隔离脊髓，使脊髓的目标区域自由漂浮。
对于横向切片，通过连接的路线将腰骶段抬起并放置在预切割聚苯乙烯块上，并在中心切割浅通道。然后，使用氰基丙烯酸酯粘合剂将块和绳索连接到切片平台上，并将其置于含有冰冷蔗糖人造CSF浆料的切割浴中。一旦获得300微米厚的切片，将切片转移到含有含氧人造CSF的空气界面孵育室中，并使切片在室温下平衡一小时。
要开始记录背角活性，请使用装有人工脑脊液的大吸头巴氏移液管将切片从培养箱转移到MEA孔中，并添加额外的人工脑脊液。使用细短的头发画笔将切片定位在60电极记录阵列上。然后，将加权的颈部放在组织上以将其固定到位并促进与MEA电极的良好接触。
将 MEA 置于录制头阶段。使用倒置显微镜检查电极上组织的位置，以确认尽可能多的电极位于表面DH下。确保至少两到六个电极不接触切片。将相机连接到设备后，拍摄相对于 MEA 的切片参考图像，以便在分析期间使用。
然后， 在 记录 软件 中 按 启动 DAQ 并 确认 所有 电极 都 接收 到 清晰 的 信号。接下来，将灌注入口和出口线连接到充满人工脑脊液的MEA孔上，然后打开灌注系统。检查流速并确保流出量足以防止过灌液溢出。
在平衡组织五分钟后，记录原始基线数据五分钟。将灌注入口管线从人工CSF移动到4-氨基吡啶溶液中，等待12分钟，以使4-氨基吡啶诱导的节律活性达到稳定状态。然后，记录5分钟的4-氨基吡啶诱导活性，并准备用于随后的记录以测试药物或检查4-氨基吡啶的稳定性。
每次录制后，用人工脑脊液冲洗线。从头阶段除去MEA并从MEA中取出网和组织后，用人造脑脊液冲洗MEA和网，并用新的切片重复整个过程。打开分析软件并加载预制的分析布局。
打开感兴趣的文件，然后取消选择参比电极和任何被认为噪声过大的电极。设置分析的时间窗口。然后，转到跨通道筛选器选项卡。
根据拍摄的图像和实验期间所做的笔记选择复杂的参比电极和参比电极，然后按“探索”，然后再继续。移动到“EAP 筛选器”选项卡，然后应用二阶高通巴特沃兹筛选器以删除 LFP 活动。移动到 LFP 筛选器选项卡并应用二阶带通巴特沃兹筛选器以删除 EAP 活动。
在EAP检测器选项卡中，确保选择自动阈值，勾选上升沿和下降沿框，并将死区时间设置为三毫秒。要设置正阈值和负阈值，请通过返回到原始数据分析器屏幕、移动时间标记、返回到 EAP 检测器选项卡并按“浏览”来检查数据。重复该过程，直到设置的检测阈值捕获 EAP，而不会捕获噪声或非生理活动。
在 LFP 检测器选项卡中，确保选择手动阈值，勾选上升沿和下降沿框，并将死区时间设置为 3 毫秒。为一个电极设置阈值，一旦满足，选择“应用于所有电极”，然后按“开始分析”。电压门控钠通道拮抗剂河豚毒素的浴液应用消除了EAP和LFP活性，证实了这些信号的尖峰依赖性。
表征了EAP或LFP诱导的4-氨基吡啶诱导活性参数的稳定性。基于4-氨基吡啶在施用后12分钟和15分钟后4-氨基吡啶诱导活性的相似性，所有活性特征加上LFPs的活性重合均稳定。该特征的EAP或LFP的特征在于在多个电极上检测到的重合事件的数量增加。
连接相邻电极的数量，以及相邻电极和LFPs之间在4-氨基吡啶刺激后连接的强度，然后是相对稳定性。切片方向是体外制剂的重要考虑因素。4-氨基吡啶刺激在SDH中诱导相似的节律活性，无论切片取向如何。
最后，为了进一步阐明4-氨基吡啶激活DH网络的相关性，应用升高的钾人工CSF溶液，并显示其引起对4-氨基吡啶刺激的类似DH反应。该方案的关键步骤是组织准备和切片的放置，通过仔细但及时的解剖以及MEA上组织的微妙最佳定位来确保组织健康，这将有助于获得高质量的结果。
