Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es die Bestimmung der Genexpression bei älteren Zebrafischlarven und Jungtieren während der Metamorphose ermöglicht. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass mehrere Schritte für die Penetration der Sonde und die Visualisierung der Niere optimiert wurden. Stellen Sie zunächst erwachsene Zebrafische für die Paarung auf, indem Sie am späten Nachmittag nach ihrer letzten Mahlzeit einen männlichen und einen weiblichen Fisch in einem Paarungsbecken hinzufügen.
Am nächsten Tag werden die Embryonen in Petriplatten mit E3-Medium gesammelt. Legen Sie fünf Tage nach der Düngung einen 400-Mikrometer-Bildschirm in einen 2,8-Liter-Tank und füllen Sie ihn mit 2 Zentimetern Systemwasser. Dann fügen Sie die Larve von einer Petriplatte hinzu.
Um die Larve zu fixieren, entfernen Sie einen Larventank zum gewünschten Zeitpunkt, dann mit einem Netz und einer Transferpipette mit abgeschnittener Spitze übertragen Sie die Larve auf die Petriplatte. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter 2% Tricain hinzu, um die Larve zu immobilisieren. Ersetzen Sie nach der Immobilisierung das Tricain durch 20 Milliliter Fixierlösung.
Nach 30 Minuten die Larve in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 25 Millilitern frischer Fixierlösung geben. Dann, um sicherzustellen, dass die Kappe fest ist, schaukeln Sie die Röhre langsam bei vier Grad Celsius für zwei Tage. Ersetzen Sie am dritten Tag die Fixierlösung durch 20 Milliliter PBST und übertragen Sie die Larve auf eine Petriplatte.
Um die Larve zu messen, legen Sie die Petriplatte auf ein flaches Lineal unter einem Seziermikroskop und bewegen Sie dann mit einem Wimpernmanipulator jede Larve auf das Lineal, um ihre Gesamtlänge zu messen. Nachdem Sie alle Larven gemessen haben, kombinieren Sie mehrere Larven ähnlicher Länge auf einem 5,5-Milliliter-Glasfläschchen mit PBST. Ersetzen Sie zur Austrocknung das PBST in der Glasfläschchen durch vier Milliliter 100% Methanol und lagern Sie die Durchstechflasche dann zwei Tage lang bei minus 20 Grad Celsius.
Ersetzen Sie zur Rehydratation das 100% Methanol durch vier Milliliter einer 75% Methanol- und 25% PBST-Lösung und rocken Sie die Durchstechflasche fünf Minuten lang. Ersetzen Sie dann die Methanol- und PBST-Lösung durch vier Milliliter frisches PBST und rocken Sie die Durchstechflasche erneut für 10 Minuten. Für die Proteinase-K-Verdauung ersetzen Sie das PBST durch zwei Milliliter einer Proteinase-K-Lösung und rocken die Durchstechflasche bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Als nächstes übertragen Sie zum Bleichen die Larve auf eine Sechs-Well-Platte und ersetzen Sie das PBST durch drei Milliliter frische Bleichlösung. Nach dem vollständigen Verschwinden der Pigmentierung entlang des Mesonephros übertragen Sie die Larve zurück in eine Glasfläschchen, ersetzen Sie die Bleichlösung durch vier Milliliter PBST und rocken Sie die Durchstechflasche für 10 Minuten. Ersetzen Sie für die Vorhybridisierung die Fixierlösung durch vier Milliliter PBST und rocken Sie die Durchstechflasche für 10 Minuten, ersetzen Sie dann das PBST durch vier Milliliter Hyb-Lösung und Gestein für 10 Minuten.
Nach zwei zusätzlichen Inkubationen in der Hyb-Lösung ersetzen Sie die Lösung durch vier Milliliter der Hyb+-Lösung. Verdünnen Sie gleichzeitig die EGFP-Fluoresceinsonde eins auf 100 in 500 Mikroliter Hybridisierung plus Lösung und inkubieren Sie die Durchstechflasche und die Sonde bei 70 Grad Celsius über Nacht. Um die Sonde zu hybridisieren, ersetzen Sie am nächsten Tag die Hyb+-Lösung in der Durchstechflasche durch die vorgewärmte Sonde und inkubieren Sie über Nacht bei 70 Grad Celsius.
Am nächsten Tag fügen Sie 50 Milliliter vorgewärmtes 0,2-faches SSCT in ein 50-Milliliter-Röhrchen hinzu. Führen Sie dann ein 100-Mikrometer-Zellsieb in die Oberseite des Röhrchens ein, übertragen Sie die Larve aus der Glasfläschchen in das Zellsieb und stellen Sie sicher, dass die Larven in den Puffer eingetaucht sind, inkubieren Sie das Fläschchen bei 70 Grad Celsius für zwei Stunden. Nach der Inkubation wird das Zellsieb in ein neues Röhrchen mit 0,2-fachem SSCT vorgewärmt und zwei Stunden lang bei 70 Grad Celsius erneut inkubiert.
Als nächstes, zum Blockieren, übertragen Sie die Larve auf eine neue Glasfläschchen und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Ersetzen Sie dann die 0,2-fache SSCT-Lösung durch vier Milliliter einer 67%0,2-fachen SSCT- und 33%igen MABT-Lösung und rocken Sie die Durchstechflasche bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Als nächstes ersetzen Sie die SSCTT MABT-Lösung durch vier Milliliter frisches MABT und inkubieren Sie die Durchstechflasche 10 Minuten lang auf einer Wippe.
Ersetzen Sie dann den MABT durch vier Milliliter Blocklösung und inkubieren Sie vier Grad Celsius über Nacht. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Blocklösung durch eine Antikörperlösung und inkubieren Sie zwei Tage lang bei vier Grad Celsius. Zum Waschen von Antikörpern die Larve in ein 50-Milliliter-Röhrchen übertragen, dann 40 Milliliter PBST2 hinzufügen und das Röhrchen auf die Seite legen, um über Nacht bei vier Grad Celsius zu inkubieren.
Ersetzen Sie am Tag 12, nachdem Sie die Lava auf eine Sechs-Well-Platte übertragen haben, den PBST2 durch drei Milliliter Färbepuffer. Nach einer fünfminütigen Inkubation auf einer Wippe den Färbepuffer durch drei Milliliter der Färbelösung ersetzen. Wenn die gewünschte Färbeintensität erreicht ist, ersetzen Sie die Färbelösung durch drei Milliliter der Stopplösung und des Gesteins für 30 Minuten.
Dann die Larve in eine neue Glasfläschchen geben, die Stopplösung durch vier Milliliter frische Fixierlösung ersetzen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Ersetzen Sie für die Bildgebung die Fixierlösung durch vier Milliliter frisches PBST. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf einer Wippe die Larve auf eine Sechs-Well-Platte übertragen, dann die PBST durch vier Milliliter frisches PBST ersetzen und die Platte erneut für 10 Minuten schaukeln.
Als nächstes fügen Sie drei Milliliter 50% Glycerin in PBST und Gestein für 10 Minuten hinzu und fotografieren Sie dann mit einem Seziermikroskop die Larve direkt in der Sechs-Well-Platte. Dieses In-situ-Hybridisierungsprotokoll markiert effektiv Nierenvorläuferzellen und verschiedene Nephronstrukturen unter Verwendung der Mesonephrosentwicklung. Das anfängliche mesonephrische Nephron bildet sich etwa 5,2 Millimeter dorsal zum Pronephros.
Cluster von Vorläuferzellen sind während der Mesonephrosentwicklung zusätzlich zu einzelnen Vorläuferzellen vorhanden. Bei größeren Jungtieren kann eine Hintergrundfärbung in den Somiten auftreten. Insgesamt kann diese Methode verwendet werden, um andere Gewebe zu untersuchen, die sich während der Metamorphose bilden, zusätzlich zu sezierten erwachsenen Organen.
