Questo protocollo è significativo perché consente la determinazione dell'espressione genica nelle larve di zebrafish più vecchie e nei giovani durante la metamorfosi. Il vantaggio di questa tecnica è che diversi passaggi sono stati ottimizzati per la penetrazione della sonda e la visualizzazione del rene. Per iniziare, prepara il pesce zebra adulto ad accoppiarsi aggiungendo un pesce maschio e una femmina in una vasca di accoppiamento nel tardo pomeriggio dopo il loro ultimo pasto.
Il giorno dopo, raccogli gli embrioni in piastre di Petri contenenti E3 medium. Cinque giorni dopo la fecondazione, posizionare uno schermo da 400 micrometri in un serbatoio da 2,8 litri e riempirlo con 2 centimetri di acqua di sistema. Quindi aggiungere la larva da una piastra di Petri.
Per fissare la larva, rimuovere un serbatoio di larva nel punto temporale desiderato, quindi, utilizzando una rete e trasferire la pipetta con la punta tagliata, trasferire la larva nella piastra di Petri. Quindi, aggiungere due millilitri di tricaina al 2% per immobilizzare la larva. Dopo l'immobilizzazione, sostituire la tricaina con 20 millilitri di soluzione fissante.
Dopo 30 minuti, trasferire la larva in un tubo da 50 millilitri contenente 25 millilitri di soluzione fissante fresca. Quindi, assicurandosi che il cappuccio sia stretto, scuotere lentamente il tubo a quattro gradi Celsius per due giorni. Il terzo giorno, sostituire la soluzione fissante con 20 millilitri di PBST, quindi trasferire la larva su una piastra di Petri.
Per misurare la larva, posiziona la piastra di Petri sopra un righello piatto sotto un microscopio sezionante, quindi, usando un manipolatore di ciglia, sposta ogni larva sul righello per misurarne la lunghezza totale. Dopo aver misurato tutte le larve, combinare diverse larve di lunghezze simili su una fiala di vetro da 5,5 millilitri con PBST. Per la disidratazione, sostituire il PBST nel flaconcino di vetro con quattro millilitri di metanolo al 100%, quindi conservare il flaconcino a meno 20 gradi Celsius per due giorni.
Per la reidratazione, sostituire il metanolo al 100% con quattro millilitri di una soluzione al 75% di metanolo e al 25% di PBST e scuotere il flaconcino per cinque minuti. Quindi, sostituire la soluzione di metanolo e PBST con quattro millilitri di PBST fresco e scuotere nuovamente il flaconcino per 10 minuti. Per la digestione della proteinasi K, sostituire il PBST con due millilitri di una soluzione di proteinasi K e scuotere il flaconcino a temperatura ambiente per 30 minuti.
Successivamente, per lo sbiancamento, trasferire la larva in una piastra a sei pozzetti e sostituire il PBST con tre millilitri di soluzione sbiancante fresca. Dopo la completa scomparsa della pigmentazione lungo il mesonefro, trasferire nuovamente la larva in una fiala di vetro, sostituire la soluzione sbiancante con quattro millilitri di PBST e scuotere la fiala per 10 minuti. Per la pre-ibridazione, sostituire la soluzione di fissaggio con quattro millilitri di PBST e scuotere la fiala per 10 minuti, quindi sostituire il PBST con quattro millilitri di soluzione Hyb e roccia per 10 minuti.
Dopo due ulteriori incubazioni nella soluzione Hyb, sostituire la soluzione con quattro millilitri della soluzione Hyb+. Diluire contemporaneamente la sonda di fluoresceina EGFP da uno a 100 in 500 microlitri di ibridazione più soluzione e incubare la fiala e la sonda a 70 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, per ibridare la sonda, sostituire la soluzione Hyb+nel flaconcino con la sonda preriscaldata e incubare a 70 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno seguente, aggiungere 50 millilitri di SSCT preriscaldato 0,2 volte in un tubo da 50 millilitri. Quindi, inserire un filtro cellulare da 100 micrometri nella parte superiore del tubo, trasferire la larva dalla fiala di vetro nel filtro cellulare e assicurarsi che la larva sia immersa nel tampone, incubare la fiala a 70 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, trasferire il filtro cellulare in un nuovo tubo contenente preriscaldato 0,2 volte SSCT e incubare nuovamente a 70 gradi Celsius per due ore.
Successivamente, per il blocco, trasferire la larva in una nuova fiala di vetro e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Quindi, sostituire la soluzione 0,2 volte SSCT con quattro millilitri di una soluzione 67%0,2 volte SSCT e 33% MABT e scuotere il flaconcino a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, sostituire la soluzione SSCTT MABT con quattro millilitri di MABT fresco e incubare il flaconcino su un bilanciere per 10 minuti.
Quindi, sostituire il MABT con quattro millilitri di soluzione bloccante e incubare quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, sostituire la soluzione bloccante con una soluzione anticorpale e incubare a quattro gradi Celsius per due giorni. Per il lavaggio degli anticorpi, trasferire la larva in un tubo da 50 millilitri, quindi aggiungere 40 millilitri di PBST2 e posare il tubo posato su un lato per l'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.
Il giorno 12, dopo aver trasferito la lava in una piastra a sei pozzetti, sostituire il PBST2 con tre millilitri di tampone di colorazione. Dopo un'incubazione di cinque minuti su un bilanciere, sostituire il tampone di colorazione con tre millilitri della soluzione di colorazione. Quando viene raggiunta l'intensità di colorazione desiderata, sostituire la soluzione di colorazione con tre millilitri della soluzione di arresto e roccia per 30 minuti.
Quindi, trasferire la larva in una nuova fiala di vetro, sostituire la soluzione di arresto con quattro millilitri di soluzione fissante fresca e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Per l'imaging, sostituire la soluzione di fissaggio con quattro millilitri di PBST fresco. Dopo un'incubazione di 10 minuti su un bilanciere, trasferire la larva in una piastra a sei pozzetti, quindi sostituire il PBST con quattro millilitri di PBST fresco e scuotere nuovamente la piastra per 10 minuti.
Quindi, aggiungere tre millilitri di glicerolo al 50% in PBST e roccia per 10 minuti, quindi, utilizzando un microscopio di dissezione, visualizzare la larva direttamente nella piastra a sei pozzetti. Questo protocollo di ibridazione in situ etichetta efficacemente le cellule progenitrici renali e varie strutture di nefrone utilizzando lo sviluppo di mesonefro. Il nefrone mesonefrico iniziale si forma a circa 5,2 millimetri dorsale al pronephros.
Gruppi di cellule progenitrici sono presenti durante lo sviluppo di mesonefros oltre alle singole cellule progenitrici. Nei giovani più grandi, la colorazione di fondo può verificarsi nei somiti. Nel complesso, questo metodo può essere utilizzato per studiare altri tessuti che si formano durante la metamorfosi, oltre agli organi adulti sezionati.
