Este protocolo é significativo porque permite a determinação da expressão genética em larvas de zebrafish mais antigas e juvenis durante a metamorfose. A vantagem dessa técnica é que várias etapas foram otimizadas para penetração da sonda e visualização do rim. Para começar, configure zebrafish adulto para acasalar adicionando um macho e uma fêmea peixe em um tanque de acasalamento no final da tarde após sua última refeição.
No dia seguinte, colete os embriões em placas de Petri contendo meio E3. Cinco dias após a fertilização, coloque uma tela de 400 micrômetros em um tanque de 2,8 litros e encha-a com 2 centímetros de água do sistema. Em seguida, adicione a larva de uma placa de Petri.
Para consertar a larva, remova um tanque de larva no ponto de tempo desejado, em seguida, usando uma rede e transfira a pipeta com sua ponta cortada, transfira a larva para a placa de Petri. Em seguida, adicione dois mililitros de 2% de tricaine para imobilizar a larva. Após a imobilização, substitua a tricaine por 20 mililitros de solução de fixação.
Após 30 minutos, transfira a larva para um tubo de 50 mililitros contendo 25 mililitros de solução fresca. Em seguida, garantindo que a tampa esteja apertada, balance lentamente o tubo a quatro graus Celsius por dois dias. No terceiro dia, substitua a solução de fixação por 20 mililitros de PBST e transfira a larva para uma placa de Petri.
Para medir a larva, coloque a placa de Petri em cima de uma régua plana sob um microscópio dissecando, em seguida, usando um manipulador de cílios, mova cada larva para a régua para medir seu comprimento total. Depois de medir todas as larvas, combine várias larvas de comprimentos semelhantes em um frasco de vidro de 5,5 mililitros com PBST. Para desidratação, substitua o PBST no frasco de vidro por quatro mililitros de 100% de metanol e, em seguida, armazene o frasco a menos 20 graus Celsius por dois dias.
Para reidratação, substitua o metanol 100% por quatro mililitros de uma solução de 75% de metanol e 25% PBST e arrase o frasco por cinco minutos. Em seguida, substitua a solução de metanol e PBST por quatro mililitros de PBST fresco e balance o frasco novamente por 10 minutos. Para digestão Proteinase K, substitua o PBST por dois mililitros de uma solução Proteinase K e balance o frasco à temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, para branqueamento, transfira a larva para uma placa de seis poços e substitua o PBST por três mililitros de solução de branqueamento fresco. Após o desaparecimento completo da pigmentação ao longo dos mesonephros, transfira a larva de volta para um frasco de vidro, substitua a solução de branqueamento por quatro mililitros de PBST, e balance o frasco por 10 minutos. Para pré-hibridização, substitua a solução de fixação por quatro mililitros de PBST e balance o frasco por 10 minutos, então, substitua o PBST por quatro mililitros de solução Hyb e a rocha por 10 minutos.
Após duas incubações adicionais na solução Hyb, substitua a solução por quatro mililitros da solução Hyb+. Diluir simultaneamente a sonda fluoresceína EGFP de um a 100 em 500 microliters de hibridização mais solução, e incubar o frasco e a sonda a 70 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, para hibridizar a sonda, substitua a solução Hyb+no frasco pela sonda pré-aquecido e incubar a 70 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, adicione 50 mililitros de 0,2 vezes SSCT pré-aquecidos em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, insira um coador de células de 100 micrômetros na parte superior do tubo, transfira a larva do frasco de vidro para o coador celular e, garantindo que a larva esteja submersa no tampão, incubar o frasco a 70 graus Celsius por duas horas. Após a incubação, transfira o coador de células para um novo tubo contendo 0,2 vezes SSCT pré-aquecido, e incuba novamente a 70 graus Celsius por duas horas.
Em seguida, para o bloqueio, transfira a larva para um novo frasco de vidro e deixe esfriar à temperatura ambiente. Em seguida, substitua a solução SSCT 0,2 vezes por quatro mililitros de uma solução SSCT de 67%0,2 vezes e 33% MABT e balance o frasco à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, substitua a solução SSCTT MABT por quatro mililitros de MABT fresco, e incuba o frasco em um roqueiro por 10 minutos.
Em seguida, substitua o MABT por quatro mililitros de solução de bloqueio e incuba quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, substitua a solução de bloqueio por uma solução de anticorpos e incubar a quatro graus Celsius por dois dias. Para a lavagem de anticorpos, transfira a larva para um tubo de 50 mililitros, depois adicione 40 mililitros de PBST2, e coloque o tubo deitado de lado para a incubação durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia 12, após transferir a lava para uma placa de seis poços, substitua o PBST2 por três mililitros de tampão de coloração. Após uma incubação de cinco minutos em um roqueiro, substitua o tampão de coloração por três mililitros da solução de coloração. Quando a intensidade de coloração desejada for atingida, substitua a solução de coloração por três mililitros da solução de parada e a rocha por 30 minutos.
Em seguida, transfira a larva para um novo frasco de vidro, substitua a solução de parada por quatro mililitros de solução de fixação fresca e incuba por uma hora em temperatura ambiente. Para imagem, substitua a solução de fixação por quatro mililitros de PBST fresco. Após uma incubação de 10 minutos em um roqueiro, transfira a larva para uma placa de seis poços, em seguida, substitua o PBST por quatro mililitros de PBST fresco e balance a placa novamente por 10 minutos.
Em seguida, adicione três mililitros de 50% de glicerol no PBST e rocha por 10 minutos, em seguida, usando um microscópio dissecando, imagem a larva diretamente na placa de seis poços. Este protocolo de hibridização in situ efetivamente rotula células progenitoras renais e várias estruturas de nefrão usando o desenvolvimento de mesonepros. O nefron mesoneférico inicial se forma a aproximadamente 5,2 milímetros dorsais aos pronephros.
Aglomerados de células progenitoras estão presentes durante o desenvolvimento de mesonepros, além de células progenitoras únicas. Em jovens maiores, a coloração de fundo pode ocorrer nas somitas. No geral, este método pode ser usado para estudar outros tecidos que se formam durante a metamorfose, além de órgãos adultos dissecados.
