Bu protokol önemlidir, çünkü metamorfoz sırasında yaşlı zebra balığı larvalarında ve yavrularında gen ekspresyonunun belirlenmesine izin verir. Bu tekniğin avantajı, prob penetrasyonu ve böbreğin görselleştirilmesi için birkaç adımın optimize edilmiş olmasıdır. Başlamak için, son yemeklerinden sonra öğleden sonra geç saatlerde bir çiftleşme tankına bir erkek ve bir dişi balık ekleyerek çiftleşmek için yetişkin zebra balığı kurun.
Ertesi gün, embriyoları E3 ortamı içeren Petri plakalarında toplayın. Döllenmeden beş gün sonra, 2.8 litrelik bir tanka 400 mikrometrelik bir ekran yerleştirin ve 2 santimetre sistem suyu ile doldurun. Sonra larvaları bir Petri tabağından ekleyin.
Larvayı düzeltmek için, istenen zaman noktasında bir larva tankını çıkarın, ardından bir ağ kullanarak ve ucu kesilmiş pipet aktarın, larvayı Petri plakasına aktarın. Daha sonra, larvayı hareketsiz hale getirmek için iki mililitre% 2 trikain ekleyin. Hareketsiz hale getirdikten sonra, trikaini 20 mililitre sabitleme çözeltisi ile değiştirin.
30 dakika sonra larvaları 25 mililitre taze sabitleme çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, kapağın sıkı olduğundan emin olarak, tüpü iki gün boyunca dört santigrat derecede yavaşça sallar. Üçüncü gün, sabitleme çözeltisini 20 mililitre PBST ile değiştirin, ardından larvayı bir Petri plakasına aktarın.
Larvayı ölçmek için, Petri plakasını bir diseksiyon mikroskobu altında düz bir cetvelin üzerine yerleştirin, ardından bir kirpik manipülatörü kullanarak, toplam uzunluğunu ölçmek için her larvayı cetvelin üzerine taşıyın. Tüm larvaları ölçtükten sonra, benzer uzunluklardaki birkaç larvayı PBST ile bir 5,5 mililitrelik cam şişede birleştirin. Dehidrasyon için, PBST'yi cam şişedeki% 100 metanol dört mililitre ile değiştirin, ardından şişeyi iki gün boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Rehidrasyon için% 100 metanolünü% 75 metanol ve% 25 PBST çözeltisinin dört mililitresi ile değiştirin ve şişeyi beş dakika sallayın. Ardından, metanol ve PBST çözeltisini dört mililitre taze PBST ile değiştirin ve şişeyi 10 dakika boyunca tekrar sallayın. Proteinaz K sindirimi için PBST'yi iki mililitre proteinaz K çözeltisi ile değiştirin ve şişeyi oda sıcaklığında 30 dakika sallayın.
Daha sonra, ağartma için larvayı altı kuyulu bir tabağa aktarın ve PBST'yi üç mililitre taze ağartma çözeltisi ile değiştirin. Mezonephros boyunca pigmentasyonun tamamen kaybolmasından sonra, larvayı bir cam şişeye geri aktarın, ağartma çözeltisini dört mililitre PBST ile değiştirin ve şişeyi 10 dakika sallayın. Ön hibridizasyon için sabitleme solüsyonunu dört mililitre PBST ile değiştirin ve şişeyi 10 dakika sallayın, ardından PBST'yi dört mililitre Hyb çözeltisi ve 10 dakika boyunca kaya ile değiştirin.
Hyb çözeltisinde iki ek inkübasyondan sonra, çözeltiyi hyb+çözeltinin dört mililitresi ile değiştirin. Egfp floresan probunu aynı anda 500 mikrolitrede 100 mikrolitre hibridizasyon artı çözelti ile seyreltin ve şişeyi ve probu bir gecede 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, probu melezlemek için şişedeki Hyb+çözeltisini önceden ısıtılmış probla değiştirin ve bir gecede 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, 50 mililitrelik bir tüpe 50 mililitre önceden ısıtılmış 0,2 kat SSCT ekleyin. Daha sonra, tüpün üstüne 100 mikrometre hücre süzgeci yerleştirin, larvaları cam şişeden hücre süzgecine aktarın ve larvaların tampona batırılmasını sağlayın, şişeyi iki saat boyunca 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre süzgecini önceden ısıtılmış 0,2 kat SSCT içeren yeni bir tüpe aktarın ve iki saat boyunca 70 santigrat derecede tekrar kuluçkaya yayalım.
Daha sonra, blokaj için larvayı yeni bir cam şişeye aktarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Ardından, 0,2 kat SSCT çözeltisini dört mililitre 67%0,2 kat SSCT ve %33 MABT çözelti ile değiştirin ve şişeyi oda sıcaklığında 10 dakika sallayın. Ardından, SSCTT MABT çözeltisini dört mililitre taze MABT ile değiştirin ve şişeyi bir rocker üzerinde 10 dakika kuluçkaya bırakın.
Ardından, MABT'yi dört mililitrelik blokaj çözeltisi ile değiştirin ve bir gecede dört santigrat derece kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, blokaj çözeltisini bir antikor çözeltisi ile değiştirin ve iki gün boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Antikor yıkama için larvayı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından 40 mililitre PBST2 ekleyin ve tüpü dört santigrat derecede gece kuluçka için yan yatırın.
12. günde, lavları altı kuyulu bir tabağa aktardıktan sonra, PBST2'yi üç mililitrelik boyama tamponu ile değiştirin. Bir rocker üzerinde beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, boyama tamponunu üç mililitrelik boyama çözeltisi ile değiştirin. İstenilen lekeleme yoğunluğuna ulaşıldığında, boyama çözeltisini üç mililitre durdurma çözeltisi ile değiştirin ve 30 dakika boyunca kayan.
Daha sonra larvayı yeni bir cam şişeye aktarın, durdurma çözeltisini dört mililitre taze sabitleme çözeltisi ile değiştirin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Görüntüleme için sabitleme çözümünü dört mililitre taze PBST ile değiştirin. Bir rocker üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyonu takiben, larvayı altı kuyulu bir tabağa aktarın, ardından PBST'yi dört mililitre taze PBST ile değiştirin ve plakayı 10 dakika boyunca tekrar sallayın.
Daha sonra, PBST'ye üç mililitre% 50 gliserol ekleyin ve 10 dakika boyunca kayan, daha sonra bir diseksiyon mikroskobu kullanarak larvayı doğrudan altı kuyu plakasında görüntüleyin. Bu in situ hibridizasyon protokolü, mezonephros gelişimini kullanarak böbrek progenitör hücrelerini ve çeşitli nefron yapılarını etkili bir şekilde etiketler. İlk mezometerik nefron pronephros için yaklaşık 5.2 milimetre sırtta oluşur.
Mezoneforo gelişimi sırasında tek progenitör hücrelere ek olarak progenitör hücre kümeleri de mevcuttur. Daha büyük gençlerde, somitlerde arka plan lekesi oluşabilir. Genel olarak, bu yöntem, parçalanmış yetişkin organlarına ek olarak metamorfoz sırasında oluşan diğer dokuları incelemek için kullanılabilir.
