Ce protocole est important car il permet de déterminer l’expression génique chez les larves et les juvéniles de poissons zèbres plus âgés lors de la métamorphose. L’avantage de cette technique est que plusieurs étapes ont été optimisées pour la pénétration de la sonde et la visualisation du rein. Pour commencer, mettez en place des poissons-zèbres adultes pour qu’ils s’accouplent en ajoutant un poisson mâle et un poisson femelle dans un aquarium d’accouplement en fin d’après-midi après leur dernier repas.
Le lendemain, recueillir les embryons dans des plaques de Petri contenant du milieu E3. Cinq jours après la fertilisation, placez un écran de 400 micromètres dans un réservoir de 2,8 litres et remplissez-le de 2 centimètres d’eau système. Ajoutez ensuite la larve d’une plaque de Pétri.
Pour fixer la larve, retirez un réservoir de larve au moment souhaité, puis, à l’aide d’un filet et d’une pipette de transfert avec son extrémité coupée, transférez la larve sur la plaque de Pétri. Ensuite, ajoutez deux millilitres de 2% de tricaïne pour immobiliser la larve. Après immobilisation, remplacer la tricaïne par 20 millilitres de solution de fixation.
Après 30 minutes, transférer la larve dans un tube de 50 millilitres contenant 25 millilitres de solution fixatrice fraîche. Ensuite, en vous assurant que le bouchon est serré, secouez lentement le tube à quatre degrés Celsius pendant deux jours. Le troisième jour, remplacez la solution de fixation par 20 millilitres de PBST, puis transférez la larve dans une plaque de Pétri.
Pour mesurer la larve, placez la plaque de Petri au-dessus d’une règle plate sous un microscope à dissection, puis, à l’aide d’un manipulateur de cils, déplacez chaque larve sur la règle pour mesurer sa longueur totale. Après avoir mesuré toutes les larves, combinez plusieurs larves de longueurs similaires sur un flacon en verre de 5,5 millilitres avec du PBST. Pour la déshydratation, remplacez le PBST dans le flacon en verre par quatre millilitres de 100% de méthanol, puis conservez le flacon à moins 20 degrés Celsius pendant deux jours.
Pour la réhydratation, remplacez le 100 % de méthanol par quatre millilitres d’une solution à 75 % de méthanol et à 25 % de PBST et faites basculer le flacon pendant cinq minutes. Ensuite, remplacez la solution de méthanol et de PBST par quatre millilitres de PBST frais et faites basculer à nouveau le flacon pendant 10 minutes. Pour la digestion de la protéinase K, remplacez le PBST par deux millilitres d’une solution de protéinase K et faites basculer le flacon à température ambiante pendant 30 minutes.
Ensuite, pour le blanchiment, transférer la larve dans une plaque de six puits et remplacer le PBST par trois millilitres de solution de blanchiment fraîche. Après la disparition complète de la pigmentation le long du mésonéphros, transférez la larve dans un flacon en verre, remplacez la solution de blanchiment par quatre millilitres de PBST et bercez le flacon pendant 10 minutes. Pour la pré-hybridation, remplacez la solution de fixation par quatre millilitres de PBST et faites basculer le flacon pendant 10 minutes, puis remplacez le PBST par quatre millilitres de solution Hyb et de roche pendant 10 minutes.
Après deux incubations supplémentaires dans la solution Hyb, remplacez la solution par quatre millilitres de la solution Hyb+. Diluer simultanément la sonde de fluorescéine EGFP de un à 100 dans 500 microlitres de solution d’hybridation plus, et incuber le flacon et la sonde à 70 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, pour hybrider la sonde, remplacer la solution Hyb+ dans le flacon par la sonde préchauffée et incuber à 70 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, ajoutez 50 millilitres de SSCT préchauffé 0,2 fois dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, insérez une passoire cellulaire de 100 micromètres dans le haut du tube, transférez la larve du flacon en verre dans la passoire cellulaire et, en veillant à ce que les larves soient immergées dans le tampon, incubez le flacon à 70 degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation, transférer la passoire cellulaire dans un nouveau tube contenant 0,2 fois SSCT préchauffé et incuber à nouveau à 70 degrés Celsius pendant deux heures.
Ensuite, pour le blocage, transférez la larve dans un nouveau flacon en verre et laissez-la refroidir à la température ambiante. Ensuite, remplacez la solution SSCT 0,2 fois par quatre millilitres d’une solution SSCT 67% 0,2 fois et 33% MABT et bercez le flacon à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, remplacez la solution SSCTT MABT par quatre millilitres de MABT frais et incubez le flacon sur un culbuteur pendant 10 minutes.
Ensuite, remplacez le MABT par quatre millilitres de solution bloquante et incubez quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, remplacez la solution bloquante par une solution d’anticorps et incubez à quatre degrés Celsius pendant deux jours. Pour le lavage des anticorps, transférez la larve dans un tube de 50 millilitres, puis ajoutez 40 millilitres de PBST2 et posez le tube posé sur le côté pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius.
Le jour 12, après avoir transféré la lave dans une plaque de six puits, remplacez le PBST2 par trois millilitres de tampon de coloration. Après une incubation de cinq minutes sur une bascule, remplacez le tampon de coloration par trois millilitres de la solution de coloration. Lorsque l’intensité de coloration souhaitée est atteinte, remplacez la solution de coloration par trois millilitres de la solution d’arrêt et de la roche pendant 30 minutes.
Ensuite, transférez la larve dans un nouveau flacon en verre, remplacez la solution d’arrêt par quatre millilitres de solution de fixation fraîche et incubez pendant une heure à température ambiante. Pour l’imagerie, remplacez la solution de fixation par quatre millilitres de PBST frais. Après une incubation de 10 minutes sur une bascule, transférez la larve dans une plaque de six puits, puis remplacez le PBST par quatre millilitres de PBST frais et secouez à nouveau la plaque pendant 10 minutes.
Ensuite, ajoutez trois millilitres de glycérol à 50% dans le PBST et la roche pendant 10 minutes, puis, à l’aide d’un microscope à dissection, imagez la larve directement dans la plaque à six puits. Ce protocole d’hybridation in situ marque efficacement les cellules progénitrices rénales et diverses structures de néphrons en utilisant le développement de mésonéphros. Le néphron mésonéphrique initial se forme à environ 5,2 millimètres dorsal au pronephros.
Des grappes de cellules progénitrices sont présentes pendant le développement du mésonéphros en plus des cellules progénitrices uniques. Chez les juvéniles plus grands, une coloration de fond peut se produire dans les somites. Dans l’ensemble, cette méthode peut être utilisée pour étudier d’autres tissus qui se forment pendant la métamorphose, en plus des organes adultes disséqués.
