Burada açıklanan meme kanseri hücre sferoidleri, araştırmacıların kanser hücrelerinin çoğalması ve metastazında yer alan kanser hücresi endotel hücre etkileşimlerinin moleküler mekanizmalarını araştırmalarına izin verecektir. Bu 3D modelin temel avantajı, meme kanserinin patofizyolojisi ve tedavisi ile ilgili çıkarımların güvenilirliğini artıran daha gerçekçi bir hücresel düzenleme sağlamasıdır. Prosedürü gösteren Giovanna Azzarito, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi.
Kaplamalı hücreleri 24 saat boyunca veya istenildiği gibi tedavi ederek veya transfecting yaparak başlayın. Küresel hücre dağılımını tanımlamak için, hücreleri kalsiyum ve magnezyum içeren bir mililitre Hanks'Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS ile yıkayın ve mililitre mavi boya başına 0,5 mikrogram kullanarak HUVEC'lerde kalın. Ve MCF-7 hücreleri 0.5 mikromoler yeşil boya kullanarak büyüme ortamı açısından seyreltilmiş.
Plakayı 30 ila 40 dakika boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2 inkübatöre yerleştirin. Hücreleri kalsiyum ve magnezyum olmadan bir mililitre HBSS ile yıkayın. Daha sonra huvec için% 0.25 trypsin ve dört MCF-7'de% 0.5 trips olan bir mililitre enzimatik müfreze re-agent ekleyin P1000 pipet kullanarak her kahverengi yemeğe.
Her hücre tipini beş mililitre yuvarlak alt polistiren tüpte ayrı ayrı seçin ve enmatik reaksiyonu durdurmak için bir P1000 pipet kullanarak bir mililitre% 10 Fetal Baldır Serumu veya FCS ortamı ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonlarını beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin. Dikkatlice süpernatant aspirat ve steroid ücretsiz ortam bir mililitre hücreleri askıya.
Toplam hücre sayısını belirlemek için 10 mililitre Seyreltici 2 ile seyreltilmiş her hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini kullanın. Makineyi açın ve işleve ve başlatma düğmelerini basarak, hücre sayacı şişesinde Seyreltici 2 çözeltisi ile yıkayın. Dört olarak ayarlayın ve boşluğu taze Seyreltici 2 çözeltisi ile ölçmek için başlayın.
10 mililitre Diluent 2 çözeltisinde 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ile scintillation şişesini değiştirin. Dört olarak ayarlayın ve örnekleri ölçmek için başla tuşuna basın. Dijital ekranda mililitre başına hücre sayısına dikkat edin, ardından her hücre süspansiyonunun beş mililitresini hazırlayın ve 96 kuyulu U-alt plakanın her kuyusuna 100 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetlamak için manuel tekrarlayan pipet kullanarak bire bir oranda 10 mililitrelik son bir hacim elde etmek için karıştırın.
Plakayı standart doku kültürü koşullarında bir inkübatöre yerleştirin ve 48 saat sonra küresel bir oluşum olup olmadığını kontrol edin. Faz kontrastı veya floresan stereo mikroskop kullanarak 40 X büyütmede bu küresellerin fotoğraflarını çekin. Asılı bırakma kültürünü hazırlamak için hücre süspansiyonlarını bire bir oranında karıştırarak iki mililitrelik son bir hacim elde edin.
Hücre karışımını 10 santimetrelik Petri kabının ters kurşununda 15 mikroliter damla şeklinde görmek için bir P20 pipet kullanın. Damlalarla kapağı ters çevirin ve damlaların buharlaşmasını önlemek için kabın altına beş mililitre EBM-2 baz orta ekleyin. P200 mikrolitre pipet ucu ile 1,5 mililitrelik bir tüpte yaklaşık 50 küresel toplayın.
Yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmelerine izin verin ve ardından süpernatant atın. Bu küreselleri oda sıcaklığında bir saat boyunca% 4 PFA'nın 500 mikrolitresi ile sabitlayın. 2% Nobel Algor Çözeltisini PBS'de, uğursuz tozu tamamen çözmek ve 60 santigrat dereceye kadar soğutmak için üç ila beş dakika boyunca manyetik bir karıştırma ile sıcak bir plaka kullanarak kaynatın.
PFA'yı bir P1000 pipetle çıkarın, bu küreselleri 500 mikrolitre PBS ile yıkayın ve tortulanmalarını bırakın. Yerleştikten sonra, süpernatant pipeti 600 mikrolitre Agora çözeltisini sferoidli 1,5 mililitrelik tüpe atın ve tüpü hemen iki dakika boyunca 177 kez G'de yatay rotorlu bir santrifüje yerleştirin. Fişi tüpten kolayca çıkarmak için Agro Çözümünün ortasına kısa bir dize ekleyin.
Agros fişini buzda katılaştırın veya dört santigrat derecede peletin kurumasını önlemek için 1,5 mililitrelik tüpe 500 mikrolitre PBS ekleyin. Stereo mikroskop kullanarak küresel bölümlerin görüntülerini alın. EBM-2 kullanılarak seyreltilmiş kalsiyum Aam ve ethidyum homodimer karışımının kuyusu başına 10 mikrolitre eklemek için gerekli çözelti miktarını bir ila 50 oranında hesaplayın.
Boyama karışımını küresellere ekleyin ve plakayı standart, doku kültürü koşulları altında 30 ila 60 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Floresan stereo mikroskobu kullanarak 40 X büyütmede resimler elde edin. U-alt plakalarda, MCF yedi hücrenin tohumlanmadan 48 saat sonra küresel oluşum gözlendi.
Ancak endotel hücreleri veya lenfatik hücreler söz konusu olduğunda sferoid oluşumu gözlenmedi. MCF yedi artı endotel hücrelerinin veya MCF yedi artı lenfatik hücrelerin bire bir oranında tohumlenmesi de küresel oluşumla sonuçlandı. MCF yedi küreselinin zamana bağlı ardışık büyümesi 24 ila 120 saat arasında kaydedildi.
Küresel boyut beş gün içinde yaklaşık 100 mikrometreden yaklaşık 200 mikrometreye yükseldi. Büyüme uyarıcısı ile tedavi edilen küresellerde artan bir büyüme oranı gözlenir. Sferoidlerin yapısı ve hücrelerinin şekli Lipofectamin varlığında kontrol oligonükleotidleri ile transfeksiyondan sonra herhangi bir anormallik göstermedi.
Proliferatif belirteçleri Ki-67'yi ifade eden hücreler bu küresellerde homojen olarak dağıtıldı. Cleave to caspase bu sferoidlerin üç lekesi dört günlük kültürden sonra kayıtsız hücreler gösterdi. Cd-31 ve Ki-67 ile bu sferoidlerdeki hücrelerin incelenmesi, hücrelerin%55'inin epitel% 45'inin endotel olduğunu ve hücrelerin% 25'inin çoğaldığını ortaya koydu.
Canlı ve ölü hücrelerin yüzdesini değerlendirmek için dört günlük küreseller kalsiyum Aam ve ethidyum-homodimer ile boyandı. Yeni düşünülmüş bir küresel de ölü ve canlı hücreler için leke, küresellerin donma koşullarına karşı çok hassas olduğunu ortaya koydu. Protokolünü takip ederken, sağlıklı hücrelerin afrodit karıştırmak için kullanıldığından emin olun Hatırlanması gereken bir diğer şey, dp kapağı sırasında bu afroditlere zarar vermekten kaçınmak ve aynı zamanda iyi bir bölüm elde etmek için afroditlerin polimerizelerden önce damak yapmasını sağlamak olacaktır.
Bu model, tümör ilerlemesine katılan fibroblastlar gibi diğer hücreler dahil edilerek ve kanser büyümesini hedefleyen terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılarak daha da geliştirilebilir.
