本明細書に記載の乳癌細胞スフェロイドは、癌細胞の増殖および転移に関与する癌細胞内皮細胞相互作用の分子機構を研究することを可能にする。この3Dモデルの主な利点は、乳がんの病態生理学と治療に関する推論の信頼性を向上させる、より現実的な細胞配置を提供することです。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、ジョヴァンナ・アザリトです。
メッキされた細胞を24時間、または望ましいように処理またはトランスフェクトすることから始めます。スフェロイドの細胞分布を識別するには、カルシウムとマグネシウムを含むハンクスバランス塩溶液またはHBSSの1ミリリットルで細胞を洗浄し、1ミリリットルの青色染料あたり0.5マイクログラムを使用してHUVECsにとどまります。そして、0.5マイクロモルグリーン色素を用いたMCF-7細胞を、増殖培地に関して希釈した。
プレートを摂氏37度、CO2インキュベーター5%に30~40分間置きます。カルシウムとマグネシウムなしでHBSSの1ミリリットルで細胞を洗います。次に、HUVECの場合は0.25%のトリプシン、P1000ピペットを使用して各ブラウンディッシュに0.5%の回来である酵素剥離再剤を1ミリリットル加えます。
各細胞タイプを5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに分けて選び、P1000ピペットを使用して10%の胎児子牛血清またはFCS培地の1ミリリットルを加えて酵素反応を止めます。その後、細胞懸濁液をGの250倍で5分間遠心分離する。上清を慎重に吸引し、ステロイドフリー培地の1ミリリットルで細胞を中断します。
各細胞懸濁液100マイクロリットルを希釈し、10ミリリットルの希釈液2を使用して、細胞の総数を決定します。セルカウンターバイアルでDiluent 2溶液を使用して、機能と開始ボタンを押すことによって、マシンとフラッシュをオンにします。4として設定し、新しいDiluent 2溶液でブランクを測定するためにスタートを押してください。
希釈液2溶液の10ミリリットルで細胞懸濁液の100マイクロリットルでシンチレーションバイアルを変更します。4として設定し、サンプルを測定するためにstartを押してください。デジタルディスプレイ上のミリリットル当たりの細胞数に注意し、各セルサスペンションの5ミリリットルを調製し、それらを混合して1対1の比率で10ミリリットルの最終体積を得るために、手動繰り返しピペットを使用して、96ウェルUボトムプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットアウトします。
プレートを標準的な組織培養条件下でインキュベーターに入れ、48時間後にスフェロイドの形成を確認します。この回転楕円体を40 X倍率で、位相コントラストまたは蛍光ステレオ顕微鏡で撮影します。吊り落ちる培養液を調製するために、細胞懸濁液を1対1の比率で混合し、2ミリリットルの最終体積を得る。
P20ピペットを使用して、10センチメートルのペトリ皿の反転したリードに15マイクロリットルの滴の形で細胞混合物を見てください。蓋を滴で反転させ、皿の底に5ミリリットルのEBM-2ベース培地を加えて、滴の蒸発を避けます。P200マイクロリットルピペットの腸先端を備えた1.5ミリリットルチューブに約50個のスフェロイドを集める。
重力でチューブの底に落ち着き、上清を捨てます。4%PFAの500マイクロリットルを室温で1時間固定します。PBSで2%ノーベルアルゴール溶液を沸騰させ、磁気攪拌付きのホットプレートを3〜5分間使用してオーガラスパウダーを完全に溶解し、摂氏60度前後まで冷却します。
P1000ピペットでPFAを取り出し、このスフェロイドを500マイクロリットルのPBSで洗い、堆積物にします。落ち着いたら、慎重にアゴラ溶液のピペット600マイクロリットルをスフェロイドで1.5ミリリットルチューブに捨て、水平ローターで水平ローターを持つ遠心分離機に2分間直ちにチューブを入れます。Agroソリューションの途中に短い文字列を追加して、チューブからプラグを簡単に取り外します。
氷の上にアグロスプラグを固めるか、または4度でペレットを乾燥させないように1.5ミリリットルチューブにPBSの500マイクロリットルを追加します。ステレオ顕微鏡を用いて、スフェロイド切片の画像を取得します。EBM-2を使用して希釈したカルシウムアムとエチジウムホモ二量体の混合物のウェルあたり10マイクロリットルを1〜50の比率で添加するために必要な溶液の量を計算する。
染色混合物をスフェロイドに加え、プレートを標準の下でインキュベーターに入れ、組織培養条件を30〜60分間行う。蛍光ステレオ顕微鏡を用いて40 X倍率で写真を取得します。U-底板では、スフェロイド形成はMCF7細胞の播種後48時間観察された。
しかし、内皮細胞やリンパ球細胞の場合にはスフェロイド形成は認められなかった。MCFに7個のプラス内皮細胞またはMCF 7プラスリンパ細胞を1対1の比率で播種することも、スフェロイド形成をもたらした。MCF 7回転楕円体の時間依存順次成長は24〜120時間の範囲で記録された。
スフェロイドのサイズは5日間で約100マイクロメートルから約200マイクロメートルに増加しました。成長刺激剤で処理されたスフェロイドで観察された増加した成長速度を有する。スフェロイドの構造およびその細胞の形状は、リポフェクトアミンの存在下でオリゴヌクレオチドを制御した後の異常を示さなかった。
これらの増殖マーカーKi-67を発現する細胞は、このスフェロイド中に均一に分布した。このスフェロイドのカスパーゼに3回染色して切断すると、4日間培養した後に無関心細胞が示された。CD-31およびKi-67を使用したこのスフェロイドの細胞の研究は、細胞の55%が上皮45%であり、細胞の25%が増殖していることを明らかにした。
生細胞および死んだ細胞の割合を評価するために、4日齢のスフェロイドをカルシウムアムとエチジウム・ホモメーターで染色した。新しい考えのスフェロイドはまた、死んだ細胞と生きた細胞のために染色し、スフェロイドは凍結状態に非常に敏感であることを明らかにしました。彼のプロトコルに従うとき、健康な細胞がアフロディーテを混合するために使用されていることを確認覚えておくべきこと覚えておくべきことは、DPキャップ中にこれらのアフロディーテを損傷することを避けることであり、重合する前にアフロディーテを口蓋する良いセクションを確保することです。
このモデルは、腫瘍の進行に関与する線維芽細胞などの他の細胞を含め、それを使用して癌増殖を標的とする治療薬の有効性を評価することによってさらに改善することができる。
