본원에 기재된 유방암 세포 스페로이드는 연구원이 암세포의 증식 및 전이에 관여하는 암세포 내피세포 상호작용의 분자 메커니즘을 조사할 수 있게 할 것이다. 이 3D 모델의 주요 장점은 유방암의 병리생리학 및 치료에 관한 추론의 신뢰성을 향상시키는 보다 현실적인 세포 배열을 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 조반나 아자리토 (Giovanna Azzarito)가 될 것입니다.
24 시간 동안 도금 된 세포를 치료하거나 변형하거나 원하는대로 처리하여 시작합니다. 스페로이드의 세포 분포를 식별하기 위해 칼슘과 마그네슘을 함유한 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 또는 HBSS 1밀리리터로 세포를 세척하고 밀리리터 블루 염료 당 0.5 마이크로그램을 사용하여 HUVEC에 머무르십시오. 및 MCF-7 세포는 0.5 마이크로몰라 녹색 염료를 사용하여 성장 배지에 대하여 희석하였다.
플레이트를 섭씨 37도, CO2 인큐베이터 5%를 30~40분간 넣습니다. 칼슘과 마그네슘없이 HBSS의 1 밀리리터로 세포를 씻어. 그런 다음 HUVEC의 경우 0.25%의 트립신인 효소 분리 재에이전트 1밀리리터를 추가하고 P1000 파이펫을 사용하여 각 갈색 접시에 4개의 MCF-7로 0.5%의 트립을 추가합니다.
각 셀 타입을 5밀리리터 라운드 바닥 폴리스티렌 튜브에서 따로 선출하고, P1000 파이펫을 사용하여 1밀리리터의 1밀리리터를 추가하여 효소 반응을 중지한다. 그런 다음 5 분 동안 250 배 G에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 조심스럽게 슈퍼 나티를 흡인 하 고 스테로이드 무료 매체의 1 밀리 리터에 세포를 일시 중단.
희석된 각 셀 서스펜션의 100마이크로리터를 Diluent 2의 10 밀리리터로 사용하여 총 세포 수를 결정하십시오. 셀 카운터 바이알에 Diluent 2 용액을 사용하면 기능을 누르고 버튼을 시동하여 기계를 켜고 플러시합니다. 4로 설정하고 신선한 Diluent 2 솔루션으로 공백을 측정하기 위해 프레스 시작으로 설정합니다.
Diluent 2 용액의 10 밀리리터에서 셀 서스펜션 100 마이크로리터로 신발성 유리병을 변경합니다. 4로 설정하고 시료를 측정하기 위해 프레스 를 누릅니다. 디지털 디스플레이에 밀리리터 당 셀의 수를 유의, 다음 각 셀 서스펜션의 다섯 밀리리터를 준비하고 1 대 1 비율로 10 밀리리터의 최종 볼륨을 얻기 위해 혼합, 96 웰 U-하단 플레이트의 각 우물에 셀 서스펜션의 100 마이크로 리터를 파이펫 수동 반복 파이펫을 사용하여.
표준 조직 배양 조건하에서 인큐베이터에 플레이트를 넣고 48시간 후에 스페로이드 형성을 확인하십시오. 위상 콘트라스트 또는 형광 스테레오 현미경을 사용하여 40 X 배율에서이 스페로이드의 사진을 찍습니다. 매달려 드롭 배양을 준비하기 위해 세포 현탁액을 일대일 비율로 혼합하여 2 밀리리터의 최종 부피를 얻습니다.
P20 파이펫을 사용하여 10센티미터 페트리 접시의 반전 된 리드에 15 마이크로 리터 방울형태의 세포 혼합물을 볼 수 있습니다. 뚜껑을 방울로 반전시키고 접시 바닥에 EBM-2 베이스 배지 5밀리리터를 추가하여 방울의 증발을 방지합니다. P200 마이크로리터 파이펫의 창자 팁이 있는 1.5 밀리리터 튜브에서 약 50개의 스페로이드를 수집합니다.
중력으로 튜브 의 바닥에 정착 한 다음 상체를 폐기 할 수 있습니다. 실온에서 1시간 동안 4%PFA의 500마이크로리터로 이 스페로이드를 수정합니다. PBS에서 2%의 노벨 알고르 용액을 3~5분 동안 마그네틱 스터디를 사용하여 끓여 서 고 육수 분말을 완전히 녹여 섭씨 60도에서 냉각하십시오.
P1000 파이펫으로 PFA를 제거하고, 500 마이크로리터의 PBS로 이 스페로이드를 세척하고 퇴적물을 허용합니다. 일단 정착하면 조심스럽게 아고라 용액의 600 마이크로 리터를 스페이펫 1.5 밀리리터 튜브에 스페이트하고 2 분 동안 수평 로터가있는 원심 분리기에 즉시 튜브를 배치합니다. Agro 솔루션 중간에 짧은 문자열을 추가하여 튜브에서 플러그를 쉽게 제거합니다.
Agros 플러그를 얼음에 고정시키거나 섭씨 4도에서 500 마이크로리터의 PBS를 1.5 밀리리터 튜브에 추가하여 펠릿을 건조시키지 않도록 합니다. 스테레오 현미경을 사용하여 스페로이드 섹션의 이미지를 습득. EBM-2를 사용하여 희석된 칼슘 아암과 에디듐 호모디머의 혼합물당 10 마이크로리터를 1~50비율로 첨가하는 데 필요한 용액의 양을 계산합니다.
스테인링 혼합물을 스페로이드에 넣고 30~60분 동안 조직 배양 조건하에서 인큐베이터에 플레이트를 배치한다. 형광 스테레오 현미경을 사용하여 40 X 배율로 사진을 획득하십시오. U-바닥 플레이트에서 스페로이드 형성은 MCF 7 세포의 파종 후 48시간 후에 관찰되었다.
그러나, 스페로이드 형성은 내피 세포 또는 림프세포의 경우 관찰되지 않았다. MCF 7 플러스 내피 세포 또는 MCF 7 플러스 림프 세포를 일대일 비율로 시드하는 것은 또한 스페로이드 형성의 결과로. MCF 7 스페로이드의 시간 의존 순차적 성장은 24시간에서 120시간까지 기록되었다.
스페로이드 크기는 약 100 마이크로미터에서 5일 동안 약 200 마이크로미터로 증가했습니다. 성장 자극기로 처리 된 스페로이드에서 관찰 된 증가 된 성장 률. 스페로이드의 구조와 세포의 모양은 Lipofectamine의 존재에 있는 통제 올리고뉴클레오티드와 함께 전환 다음 아무 이상도 보여주지 않았습니다.
증식 마커 Ki-67을 발현하는 세포는 이 스페로이드에 균질하게 분포되었다. 이 스페로이드의 세 가지 염색을 카스파스에 클리브는 문화의 4 일 후 냉담 한 세포를 보였다. CD-31 및 Ki-67을 가진 이 스페로이드에 있는 세포의 공부는 세포의 55%가 상피 45%이고 세포의 25%가 증식하고 있다는 것을 밝혔습니다.
살아있는 세포와 죽은 세포의 비율을 평가하기 위해 4 일 된 스페로이드는 칼슘 아암과 에디듐 호모디머로 염색되었다. 갓 생각 한 스페로이드는 또한 죽은 및 살아있는 세포에 대 한 얼룩 은 스페로이드동결 조건에 매우 민감한 것으로 나타났다. 그의 프로토콜을 따르는 때, 건강한 세포가 최음제혼합하는 데 사용되어 있는지 확인하는 것은 DP 캡 동안 이러한 최음제 손상을 피하기 위해 DP 캡 동안 이 최음제손상을 피하는 것입니다 또한 전체 중합전에 최음제입하는 보장.
이 모형은 종양 진행에 관련시키는 섬유아세포와 같은 그밖 세포를 포함하고 암 성장을 표적으로 하는 치료약의 효험을 평가하기 위하여 그것을 사용하여 더 향상될 수 있었습니다.
