Сфероиды клеток рака молочной железы, описанные здесь, позволят исследователям исследовать молекулярные механизмы взаимодействия эндотелиальных клеток раковых клеток, которые участвуют в пролиферации и метастазировании раковых клеток. Основным преимуществом этой 3D-модели является то, что она обеспечивает более реалистичное клеточное расположение, что повышает надежность выводов относительно патофизиологии и лечения рака молочной железы. Продемонстрировать процедуру будет Джованна Аззарито, аспирант из моей лаборатории.
Начните с обработки или трансфекции позолоченных клеток в течение 24 часов или по желанию. Для выявления клеточного распределения в сфероиде промывайте клетки одним миллилитром раствора сбалансированной соли Хэнкса или HBSS, содержащего кальций и магний, и оставайтесь в HUVECs, используя 0,5 мкг на миллилитр синего красителя. А клетки MCF-7 с помощью 0,5 микромолярного зеленого красителя разбавляют в отношении питательной среды.
Поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов цельсия и пяти процентов CO2 на 30-40 минут. Промыть клетки одним миллилитром HBSS без кальция и магния. Затем добавляют один миллилитр ферментативного реагента отслоения, который составляет 0,25% трипсина для HUVEC и 0,5% трипов в четырех MCF-7 к каждой коричневой посуде с использованием пипетки P1000.
Выберите каждый тип клеток отдельно в пятимиллилитровой полистирольной трубке с круглым дном и добавьте один миллилитр 10% фетальной икроножной сыворотки или среды FCS, используя пипетку P1000, чтобы остановить ферментативную реакцию. Затем центрифугируют клеточные суспензии в 250 раз G в течение пяти минут. Осторожно аспирируйте супернатант и подвешивайте клетки в одном миллилитре свободной от стероидов среде.
Используйте 100 микролитров каждой клеточной суспензии, разбавленной 10 миллилитрами разбавителя 2, чтобы определить общее количество клеток. Включите машину и смойте, нажав кнопки функции и запуска, с раствором Разбавителя 2 во флаконе счетчика клеток. Используйте установку как четыре и нажмите start, чтобы измерить заготовку свежим раствором Разбавителя 2.
Изменить сцинтилляционный флакон со 100 микролитрами клеточной суспензии на 10 миллилитров раствора разбавителя 2. Используйте настройку как четыре и нажмите кнопку пуск, чтобы измерить образцы. Обратите внимание на количество ячеек на миллилитр на цифровом дисплее, затем подготовьте пять миллилитров каждой клеточной суспензии и перемешайте их, чтобы получить конечный объем 10 миллилитров в соотношении один к одному, используя ручную повторяющуюся пипетку для пипетки из 100 микролитров клеточной суспензии в каждую скважину 96-луночной U-образной нижней пластины.
Поместите пластину в инкубатор в стандартных условиях культивирования тканей и проверьте образование сфероидов через 48 часов. Фотографируйте эти сфероиды с увеличением 40 X с помощью фазового контраста или флуоресцентного стереомикроскопа. Для приготовления подвесной капельной культуры смешайте клеточные суспензии в соотношении один к одному, чтобы получить конечный объем в два миллилитра.
Используйте пипетку P20, чтобы увидеть клеточную смесь в виде 15 микролитровых капель на перевернутом свинце 10-сантиметровой чашки Петри. Переверните крышку с каплями и добавьте пять миллилитров базовой среды EBM-2 на дно тарелки, чтобы избежать испарения капель. Соберите около 50 сфероидов в трубку объемом 1,5 миллилитра с кишечным наконечником микролитровой пипетки P200.
Позвольте им осесть на дно трубки под действием силы тяжести, а затем выбросьте супернатант. Зафиксируйте эти сфероиды с помощью 500 микролитров 4% PFA в течение одного часа при комнатной температуре. Вскипятите 2% раствор Nobel Algor в PBS, используя горячую плиту с магнитным перемешиванием в течение трех-пяти минут, чтобы полностью растворить авгурный порошок и остыть примерно до 60 градусов цельсия.
Удалите PFA пипеткой P1000, промыте эти сфероиды 500 микролитрами PBS и дайте им отстояться. После оседания выбросьте супернатант аккуратно пипетку 600 микролитров раствора Agora в 1,5 миллилитровую трубку со сфероидами и поместите трубку сразу в центрифугу с горизонтальным ротором в 177 раз G на две минуты. Добавьте короткую нить в середину раствора Agro, чтобы легко извлечь пробку из трубки.
Затвердьте пробку Agros на льду или при четырех градусах Цельсия добавьте 500 микролитров PBS в трубку объемом 1,5 миллилитра, чтобы избежать высыхания гранул. Получение изображений сфероидных участков с помощью стереомикроскопа. Рассчитать количество раствора необходимо для добавления 10 микролитров на лунку смеси гомодимеров кальция Aam и этидия, разбавленных с помощью EBM-2 в соотношении один к 50.
Добавьте окрашивающую смесь к сфероидам и поместите пластину в инкубатор по стандарту, в условиях культивирования тканей на 30-60 минут. Получайте снимки с увеличением 40 X с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. В U-нижних пластинах образование сфероидов наблюдалось через 48 часов после посева семи клеток MCF.
Однако образование сфероидов не наблюдалось в случае эндотелиальных клеток или лимфатических клеток. Посев mcf семь плюс эндотелиальные клетки или MCF семь плюс лимфатические клетки в соотношении один к одному также привел к образованию сфероидов. Зависящий от времени последовательный рост МФУ семи сфероидов был зафиксирован в диапазоне от 24 до 120 часов.
Размер сфероидов увеличился с примерно 100 микрометров до примерно 200 микрометров за пять дней. При повышенной скорости роста наблюдается у сфероидов, получавших стимулятор роста. Структура сфероидов и форма их клеток не показали аномалий после трансфекции контрольными олигонуклеотидами в присутствии липофектамина.
Клетки, экспрессирующие свой пролиферативный маркер Ki-67, были распределены в этом сфероиде однородно. Расщепление до каспазы трех окрашиваний этого сфероида показало апатичные клетки после четырех дней культивирования. Изучение клеток в этих сфероидах с CD-31 и Ki-67 показало, что 55% клеток являются эпителиальными, 45% являются эндотелиальными и 25% клеток пролиферируют.
Для оценки процента живых и мертвых клеток четырехдневные сфероиды окрашивали кальцием Aam и этидием-гомодимером. Недавно разработанный сфероид также окрашивает мертвые и живые клетки, который показал, что сфероиды очень чувствительны к условиям замерзания. Следуя его протоколу, убедитесь, что здоровые клетки используются для смешивания афродит Еще одна вещь, которую следует помнить, - это избегать повреждения этих афродит во время крышки DP, чтобы получить хорошие участки, также гарантирующие вкус афродиты до того, как поперечная полимеризация.
Эта модель может быть дополнительно улучшена путем включения других клеток, таких как фибробласты, участвующие в прогрессировании опухоли, и использования ее для оценки эффективности терапевтических агентов, нацеленных на рост рака.
