全麻醉血友病A小鼠尾静脉横断出血模型

尾部出血模型可以成为评估体内止血化合物药理作用的重要工具，以确保实验之间的可重复性。与其他敏感出血模型相比，我们的模型使用失血和出血时间作为终点，而不是生存。此外，该模型在麻醉下进行，从而减轻了动物的痛苦和痛苦。

该技术对于血友病和其他凝血障碍的临床前研究特别有用，因为它测量血液在损伤后凝结和阻止出血的能力。我们已经广泛使用该模型，在我们的工作中测试促凝化合物，以开发使用血友病A小鼠的新型血友病疗法。然而，也可以使用其他血友病小鼠菌株，或用抗因子VIII抗体诱导血友病的小鼠。

展示实验的将是Sarah和Dennis，他们是我实验室的专家技术人员。麻醉鼠标后，将其放在加热板上，并确保鼻子在鼻锥中。涂抹合适的眼药膏，以防止麻醉时干燥。

使用尾部标记块将尾巴标记为直径为2.5毫米，注意不要将尾巴强行插入狭缝并确保其紧密贴合。然后，将尾部放入盐水管中至少五分钟，以确保温暖的尾静脉最适合静脉给药。如有必要，可以在五分钟后进行IV给药。

然后，在鼠标上盖上塑料盖以减少热量损失。在测试溶液加药后，将尾部浸没5分钟，然后将尾部放入切割块中并将其旋转90度以暴露静脉，从而进行尾静脉横断。在从测试溶液加样的另一侧进行切割。

将11号手术刀刀片穿过切割块的狭缝，握住尾巴，产生出血。然后，立即将尾巴放回盐水并重置秒表。出血应立即可见。

将尾巴浸入生理盐水中对于持续出血很重要，因为它会很快停止在自由空气中。观察出血情况，并在血流记谱纸上注释出血的开始和停止40分钟。如果切口后三分钟内原发性出血未停止，则取消资格并更换小鼠，这可能表明切口太深或小鼠缺乏原发性止血。

如果没有出血，在受伤后10分钟，20分钟和30分钟挑战尾巴切口。使用浸泡过的纱布拭子和温盐水，将尾巴从盐水中取出，用湿纱布在尾部切口的远端方向上轻轻但牢固地擦拭两次。每次挑战后立即将尾巴重新浸入盐管中。

实验完成后，从盐水中取出尾巴，根据需要收集血液样本，并在完全麻醉下对小鼠实施安乐死。在室温下用盐水以4， 000倍G离心15毫升的血液收集管5分钟。从管中丢弃上清液。

将沉淀重悬于两毫升红细胞裂解溶液中。然后，用最多12毫升额外的裂解溶液稀释它，直到它达到淡咖啡色。注意总体积并将两毫升稀释液转移到血红蛋白管中。

冷藏直至血红蛋白分析。使用优化方案观察到重组凝血因子VIII治疗组的失血量显着减少。每公斤20国际单位的剂量使出血完全正常化，每公斤10 IU引起显着影响，将失血量减少到接近野生型范围的上限。

出血时间观察到类似的结果。在每千克组5，10和20 IU中观察到减少，在每kg组20 IU中完全归一化。在野生型小鼠中，总失血量范围为200至840纳摩尔血红蛋白，在载体小鼠中，总失血量为5， 300至7， 100纳摩尔血红蛋白。

在载体处理的小鼠中平均出血为5， 200纳摩尔，在每千克20IU组中为720纳摩尔。野生型小鼠的出血时间范围为1至9分钟，每公斤10和20 IU的剂量水平将出血时间减少到该范围内。在合并数据中观察到失血量与出血时间之间的强相关性。

所有记录的出血发作都被绘制出来，以提供每只小鼠所经历的出血长度和次数的可视化。请注意，在载体组中，在第二次挑战之后，大多数动物继续出血直到实验结束。血浆因子VIII浓度的测量证实，观察到的减少失血和出血时间的效果是重组因子VIII浓度依赖性的。

在接受中等和较高重组因子VIII剂量的动物中，血小板计数没有明显受到影响，血细胞比容水平在正常范围内，但在广泛出血的动物中显着降低，例如在载体中和每公斤组1IU。在经历大量出血的动物中，可能会发生对血细胞计数的轻微影响，特别是总血红蛋白或血细胞比容。为了评估性别在该优化模型中的影响，对失血量和出血时间结果均进行了双向方差分析，以性别和剂量为因素。

这些结果表明，对治疗的反应在性别之间没有差异。正确标记尾部并创建切割是确保技术可靠性和可重复性的基本步骤，如果没有出血，也是挑战。此外，良好的麻醉诱导和维持动物体温特别重要。

我们还使用此模型来研究在诱导出血后10分钟用VIIA因子治疗，在更按需的环境中停止已建立的出血。