该方法使EYFP标记CENP-A蛋白的泛化成为可能。它也可以应用于具有不同测试和其他蛋白质的人类CENP-A蛋白。这样做的主要优点是，它可用于识别具有关键生物学意义的EYFP CENP-A K124R无所不在的位点。
它可以扩展，以研究各种功能蛋白的翻译后修饰。首先制备蛋白质 A 珠与抗 GFP 抗体结合。每次免疫沉淀反应中，至少用缓冲器 A1 清洗 25 微升蛋白质 A 珠以去除乙醇。
然后使用缓冲器 A1 制作 50% 珠子溶液。在珠子中加入两种抗GSP抗体微升。然后将缓冲区 A1 添加到净珠体积的 20 倍。在 4 摄氏度下进行端到端旋转，时间长达 4 至 18 小时。
旋转的最佳持续时间必须根据免疫沉淀的效率从经验上确定。旋转后，以 100 次 g 离心珠一分钟，取出未绑定的上经剂。添加缓冲液 A1，使珠子溶液达到 50%，并将该溶液的 25 微升用于每次免疫沉淀反应。
为了执行免疫沉淀，通过声波和冻结/解冻将细胞在缓冲器 A1 中。测量蛋白质浓度，使不同IP样本中的蛋白质含量正常化。然后从每个管中取出 5% 的样品，以在 SDS 页中运行。
将其余糖酸盐与25微升蛋白 A 珠混合，与抗 GFP 抗体结合，在 4 摄氏度下进行端到端旋转，时间长达 4 至 18 小时。在缓冲液 A 中对细胞进行碱液化并执行上述免疫沉淀后，保留 10% 的总免疫沉淀物以确认 EYFP CENP-A 泛化，并精确确定泛基化 EYFP CENP-A 的位置。使用其他 90% 进行质谱分析。
在市售的 4-12% 比斯-特里斯蛋白凝胶中运行质谱仪。然后执行库马西蓝色染色，并切除 50-70 千吨凝胶区域进行质谱分析。将每个凝胶片切成小块，放入0.5毫升低蛋白结合管中。
用 25 毫摩尔碳酸氢铵中的 100 微升 50%乙酰酸酯清洗凝胶片。旋转他们10-15分钟。然后旋转下来，丢弃上一液。
上次洗涤后，使用台式真空浓缩器将凝胶片干燥 30 分钟。添加10微升10纳米每微升测序等级的尝试，让凝胶片补充水分5分钟。然后加入25毫摩尔碳酸氢铵，刚好够覆盖凝胶片，并在37摄氏度下一夜之间消化。
第二天，将消化的上清液转移到一个干净的0.65毫升硅化管中，并加入50%的乙酰酸和5%的甲酸溶液。旋转样品10分钟。然后将其向下旋转，将上一液转移到萃取管中。
再次将样品集中到两个微升。然后加入8微升的3%乙酰酸和2%的甲酸溶液。旋转它15分钟，旋转它16，000次g30分钟。
使用液相色谱系统与质谱仪配合使用 LC-MS/MS 执行 MS 数据采集。将样品的8微升注入反相液相色谱柱中，按照手稿指示在60分钟内用2-80%的溶剂B梯度分离肽。使用依赖于数据的采集模式收集质谱数据。
打开商业软件，分析桌面上的质谱数据。要开始新的搜索，请单击顶部菜单上的 LC 按钮。然后单击添加按钮上载原始 MS 原始数据文件。
在 paragon 方法中选择人类蛋白质 ID 作为数据库搜索方法，并针对 UniProt 智人数据库搜索原始 MS 原始数据文件。选择 trypsin 作为消化酶，并根据手稿方向设置其余参数。输入结果文件名，然后单击菜单右侧的"保存为按钮"。
然后选择一个用于存储搜索结果的文件夹，然后单击保存按钮。单击"进程"按钮开始搜索。搜索结束后，输入的搜索名称的数据将自动存储在所选文件夹中。
要获取任何特定肽的MS/MS光谱，请打开软件F中的搜索结果，然后单击顶部菜单中蛋白质列表中的蛋白质，然后单击中间菜单中的肽。此肽的 MS/MS 将显示在菜单底部。要导出和保存 MS/MS 光谱，请复制该光谱并将其粘贴到合适的文件格式。
EYFP CENP-A野生型或K124R突变体的基因构造，在进行逆转录病毒整合时，稳定地表达了内源性CENP-A的丧失。在Cre重组酶的诱导7天后，未检测到内源CENP-A的表达。EYFP CENP-A野生型和K124R蛋白表达均与最初的内源CENP-A蛋白水平相似。
EYFP CENP-A野生型和K124R突变体在内生CENP-A的剩余表达中断后7天显示中端定位。EYFP CENP-A 野生类型和 K124R 突变体显示泛化和与 HJURP 的相互作用，与标记标记或未标记的 CENP-A 野生类型和 K124R 突变体的情况不同。细胞生存能力通过执行菌落生长测定14天后，其余内源CENP-A等位基因的破坏评估。
EYFP CENP-A野生型和K124R突变体在其余内源CENP-A等位基因中断14天后，都显示出类似数量的获救菌落。IP质谱法在CENP-A中用ENP-A K124R中叶酸306的泛化与CENP-A减去F细胞。总之，这些结果表明，大尺寸蛋白质的融合在CENP-A中，在K124R以外的Lysine上诱导泛基化，从而抑制了原有的K124R单突变表型。
尝试此协议时，使用市售的 4%12%Bis-Tris 蛋白凝胶运行质谱仪样品。在凝胶片中加入足够的三辛，并补液，直到所有酶被吸收。降低分子量标记或探测技术实际上是需要可视化泛基化和调查空间时间蛋白泛化信号在和整个生物体的水平。
