微图案透射电子显微镜网格，用于在全细胞冷冻电子断层扫描工作流程中指导细胞定位

我们的研究团队开发冷冻电子显微镜和冷冻电子断层扫描的技术和方案。我们已经开发了用于微图案TEM网格的方案，以指导冷冻ET实验的细胞生长和定位。全细胞冷冻电子断层扫描用于在天然冷冻水合状态下保存的细胞内产生纳米级大分子复合物的分辨率结构。

微图案化可以提高全细胞冷冻电子显微镜、冷冻相关光电子显微镜和冷冻聚焦离子束研磨实验的通量。EM网格上细胞的数量和分布对于全细胞冷冻ET研究至关重要。该协议提供了一种快速，可重复且适应性广泛的方法，可通过微图案化引导EM网格上的细胞生长。

研究者应能够舒适地使用移液器、镊子、基本细胞培养技术以及荧光和透射电子显微镜。首次进行图案化时，请使用众所周知的细胞类型和 ECM 组合，并在盖玻片或 MatTek 培养皿上进行测试。参与该协议开发的研究团队成员是:博士。

Brian Sibert，Joseph Kim先生和Jae Yang博士。首先，将网格转移到网格准备支架上，然后发光将网格的碳面向上排放。接下来，将碳侧的网格转移到干净的载玻片或盖玻片上，网格之间至少相隔一厘米。

将10微升0.05聚-L-赖氨酸移液到每个网格上，并将网格在潮湿的腔室中孵育至少30分钟。孵育后，用15微升0.1摩尔HEPES在pH 8.5下洗涤每个网格三次。在每次洗涤中孵育网格30秒，然后用移液器从网格中取出大部分液体，而不让网格干燥。

最终洗涤后，将每个网格留在15微升0.1摩尔HEPES中。接下来，准备PEG-SVA溶液，并立即用10微升PEG-SVA溶液替换网格上的HEPES溶液，然后将网格在潮湿的室内孵育至少一小时。孵育后，用15微升无菌水洗涤每个网格三次，在每次洗涤中孵育网格30秒。

最后洗完后，将每个网格留在15微升水中。将一微升水滴放在新的干净盖玻片的中心，然后小心地将网格从15微升的水滴转移到新盖玻片上的水滴上，碳侧朝上。接下来，小心地将PDMS钢网放置在网格上方，保持网格居中，并尽量减少钢网与网格碳箔的接触。

然后将一微升PLPP凝胶加入网格中，轻轻移液以混合。将带有网格的盖玻片移动到黑暗位置以干燥。凝胶将在15到30分钟内干燥。

对于微图案，请从显微镜打开带有实时明场视图的软件。要为初始运行设计新模板，请选择"添加 ROI"，然后选择一个 3， 000 微米圆圈。使用屏幕上的明场图像作为指导，将圆圈 ROI 放置在网格上，然后按"锁定"以确保 ROI。

将 ROI 锁定到位后，选择"添加图案"并选择适当的图案。使用复制选项，生成初始模式的副本以创建八乘八的网格正方形区域。根据需要调整间距和角度，使图案与网格正方形对齐。

将图案定位在网格的一角。接下来，复制图案，并根据需要在每个区域移动显微镜载物台的网格的四个角中放置一个副本。使用复制选项将八乘八的网格正方形区域修改为要放置在中心两侧的二乘八网格正方形区域。

将中心的四个网格正方形保持无图案。对于每种模式，如有必要，调整总剂量。每平方毫米30毫焦耳是一个很好的起点。

在"专家选项"下，迭代调整模式的角度、位置、间距和比率，以优化模式与网格正方形的对齐方式。移动显微镜载物台以更改明场显示屏中的网格区域。定位模板和模式后，在软件的操作面板中取消选中除一个区域之外的所有区域。

使用显微镜载物台导航到该区域并聚焦在碳箔上。单击操作面板中的眼球图标以关闭图案叠加显示。网格对焦后，关闭明场快门，然后按软件右下角的"播放"图标开始图案化过程，可以实时监控。

重复此步骤，直到所有区域都已阵列化。最后，从显微镜中取出带有网格的盖玻片，并立即将10微升无菌PBS添加到网格上。10分钟后，用镊子取下模板，然后用15微升PBS洗涤网格三次，并将PBS中的每个网格留在黑暗的位置。

为每个网格准备15微升的细胞外基质，然后用15微升的细胞外基质替换每个网格中的PBS，并将网格在潮湿的腔室中孵育至少一小时。孵育后，如前所述，用15微升无菌PBS洗涤每个网格五次。最后一次洗涤后，将每个网格留在PBS中。

使用荧光显微镜检测细胞外基质中的荧光团以确认图案化以及碳箔保持完整。接种在微图案和无图案TEM网格上的HeLa细胞通过使用基于钙黄素AM和乙锭同源二聚体-1的细胞活力测定的荧光染色可见。使用混合的胶原蛋白和纤维蛋白原细胞外基质，HeLa细胞很容易粘附在整个网格中的模式。

沿着模式扩展的细胞的整体形态与在无图案网格上生长的细胞相似。接种后18小时RSV感染的BEAS-2B细胞的明场图像显示细胞沿模式的中心区域粘附和生长。大多数受感染的细胞位于梯度模式的高密度中心区域。

RSV变体位于微图案网格上生长的受感染BEAS-2B细胞的外围附近。许多RSV结构蛋白在断层扫描中鉴定出来，包括核衣壳和病毒融合蛋白。在微图案网格上，由于荧光标记及其在微模式中的位置，具有泛神经元GFP表达的果蝇神经元可以很容易地通过光学显微镜跟踪。

未图案网格上的神经元也可以通过光显微镜通过GFP信号跟踪。然而，由于细胞碎片和介质污染，在冷冻电子显微镜下定位它们变得困难。由于神经元细胞体的尺寸和扩展的神经突起，冷冻电子断层扫描倾斜系列沿着具有较高放大倍率的细胞较薄区域收集。

神经元细胞膜、线粒体、微管、肌动蛋白丝、囊泡结构和大分子（如核糖体）在更高倍率的图像蒙太奇和切片中通过3D断层扫描得到很好的分辨。从无模式神经元的3D断层扫描中观察到类似的亚细胞特征。将模板涂布到网格上并添加PLPP凝胶是影响图案化结果的最敏感步骤，应谨慎进行。

Cryo-CLEM可用于定位细胞内感兴趣的靶标，以进行冷冻ET数据收集。Cryo-FIB-SEM可用于在太厚而无法收集数据的区域上稀释细胞。