Araştırma ekibimiz kriyo-elektron mikroskopisi ve kriyo-elektron tomografisi için teknolojiler ve protokoller geliştirmektedir. Hücre büyümesini ve kriyo-ET deneyleri için konumlandırmayı yönlendirmek için TEM şebekelerinin mikropatterning için protokoller geliştirdik. Tüm hücreli kriyo-elektron tomografisi, yerel donmuş hidratlı durumda korunmuş hücreler içindeki makromoleküler komplekslerin nanometre düzeyinde çözünürlük yapıları üretmek için kullanılır.
Mikropatterning, tüm hücreli kriyo-ET, kriyo korelatif ışık elektron mikroskopisi ve kriyo odaklı iyon ışın frezeleme deneylerinin verimini artırabilir. EM ızgaralarındaki hücrelerin sayısı ve dağılımı tüm hücreli kriyo-ET çalışmaları için çok önemlidir. Bu protokol, mikropatterning yoluyla EM ızgaralarında hücre büyümesini yönlendirmek için hızlı, tekrarlanabilir ve geniş ölçüde uyarlanabilir bir yöntem sağlar.
Araştırmacı pipetler, cımbızlar, temel hücre kültürü teknikleri ve floresan ve iletim elektron mikroskoplarını kullanarak rahat olmalıdır. İlk kez desenlerken, iyi bilinen bir hücre tipi ve ECM kombinasyonu kullanın ve bunları kapak örtüleri veya MatTek yemeklerinde test edin. Bu protokol geliştirmesinde yer alan araştırma ekibi üyeleri şunlardır:Dr.
Brian Sibert, Bay Joseph Kim ve Dr. Jae Yang. Başlamak için ızgaraları bir ızgara hazırlık tutucusuna aktarın ve izgaraları karbon tarafı yukarı doğru boşaltın. Daha sonra, karbon tarafı olan ızgaraları, ızgaralar arasında en az bir santimetrelik bir ayrımla temiz bir cam kaydırağa veya kapak ucuna aktarın.
Pipet Her ızgaraya 0,05 poli-L-lizin 10 mikrolitre ve ızgaraları nemli bir odada en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her ızgarayı pH 8.5'te 0.1 molar HEPES'in 15 mikrolitresi ile üç kez yıkayın. Izgarayı her yıkamada 30 saniye boyunca kuluçkaya bırakın, ardından ızgaranın kurumasına izin vermeden sıvının çoğunu bir pipetle ızgaradan çıkarın.
Son yıkamadan sonra, her ızgarayı 0,1 molar HEPES'in 15 mikrolitresinde bırakın. Daha sonra, PEG-SVA çözeltisini hazırlayın ve ızgaralardaki HEPES çözeltisini derhal PEG-SVA çözeltisinin 10 mikrolitresi ile değiştirin, ardından ızgaraları nemli bir odada en az bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her ızgarayı 15 mikrolitre steril su ile üç kez yıkayın ve ızgarayı her yıkamada 30 saniye boyunca inkübe edin.
Son yıkamadan sonra, her ızgarayı 15 mikrolitre suda bırakın. Yeni bir temiz kapak kapağının ortasına bir mikroliter damla su yerleştirin, ardından ızgarayı 15 mikroliter su damlasından karbon tarafı yukarı olacak şekilde yeni kapaktaki düşüşe dikkatlice aktarın. Daha sonra, ızgarayı ortalanmış tutarak ve ızgaranın karbon folyosuyla kalıbın temasını en aza indirerek ızgaranın üzerindeki PDMS kalıbına dikkatlice yerleştirin.
Daha sonra ızgaraya bir mikroliter PLPP jel ekleyin ve karıştırmak için yavaşça pipet ekleyin. Izgara ile kapak kapağını kurumak için karanlık bir konuma taşıyın. Jel 15 ila 30 dakika içinde kurur.
Mikropatterning için, yazılımı mikroskoptan canlı brightfield görünümüyle açın. İlk çalıştırma için yeni bir şablon tasarlamak için Yatırım getirisi ekle'yi seçin ve 3.000 mikrometre daire seçin. Ekrandaki Brightfield görüntüsünü kılavuz olarak kullanarak daire yatırım getirisini ızgaranın üzerine getirin, ardından yatırım getirisini sabitlemek için Kilitle'ye basın.
Yatırım getirisini yerinde kilitledikten sonra Desen Ekle'yi seçin ve uygun deseni seçin. Çoğaltma seçeneklerini kullanarak, sekize sekiz kılavuz kare bölgesi oluşturmak için başlangıç deseninin kopyalarını oluşturun. Desenleri ızgara kareleriyle hizalamak için aralığı ve açıyı gerektiği gibi ayarlayın.
Deseni ızgaranın bir köşesine yerleştirin. Ardından, deseni çoğaltın ve mikroskop aşamasını her bölge için gerektiği gibi hareket ettirerek ızgaranın dört köşesinin her birine bir kopya yerleştirin. Sekize sekiz ızgara kare bölgesini, merkezin her iki tarafına yerleştirilecek ikiye sekiz kılavuz kare bölgesine değiştirmek için çoğaltma seçeneklerini kullanın.
Orta dört ızgara karesini karşılıksız bırakın. Her desen için gerekirse toplam dozu ayarlayın. Milimetre kare başına 30 milijoule iyi bir başlangıç noktasıdır.
Uzman Seçenekleri altında, desenin ızgara kareleriyle hizalamasını iyileştirmek için desenin açısını, konumunu, boşluğu ve oranını ayarlamayı yinele. Brightfield ekranındaki ızgara bölgesini değiştirmek için mikroskop aşamasını hareket ettinin. Şablon ve desenler konumlandıktan sonra, yazılımın eylem panelinde yer alan bölgelerden biri hariç tüm bölgelerin işaretini kaldırın.
Mikroskop aşamasını kullanarak o bölgeye gidin ve karbon folyoya odaklanın. Desen yer paylaşımı görüntüsünü kapatmak için eylem panelinde göz küresi simgesine tıklayın. Izgara netleme işlemine başladıktan sonra Brightfield deklanşörünü kapatın ve yazılımın sağ alt köşesindeki Oynat simgesine basarak canlı olarak izlenebilen desenleme işlemine başlayın.
Tüm bölgeler desenlenene kadar bu adımı yineleyin. Son olarak, ızgara ile kapak çizgisini mikroskoptan çıkarın ve hemen ızgaraya 10 mikrolitre steril PBS ekleyin. 10 dakika sonra, kalıbı cımbızla çıkarın, ardından ızgarayı 15 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve her ızgarayı PBS'de karanlık bir konumda bırakın.
Her ızgara için hücre dışı matrisin 15 mikrolitresini hazırlayın, ardından her ızgaradan PBS'yi hücre dışı matrisin 15 mikrolitresi ile değiştirin ve ızgarayı nemli bir odada en az bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her ızgarayı daha önce gösterildiği gibi 15 mikrolitre steril PBS ile beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, her ızgarayı PBS'de bırakın.
Floresan mikroskop kullanarak, desenlenmeyi ve karbon folyonun bozulmadan kaldığını doğrulamak için hücre dışı matristeki floroforu tespit edin. Mikropatterned ve unpatterned TEM ızgaraları üzerine tohumlanmış HeLa hücreleri, bir kalsein ve ethidium homodimer-1 bazlı hücre canlılığı tahlilleri kullanılarak floresan boyama ile görülebilir. Karışık bir kollajen ve fibrinojen hücre dışı matris kullanan HeLa hücreleri, ızgaradaki desenlere kolayca yapışır.
Desen boyunca genişleyen hücrelerin genel morfolojisi, bölünmemiş ızgaralarda yetişen hücrelerinkine benzer. RSV enfekte BEAS-2B hücrelerinin Brightfield görüntüsü tohumlamadan 18 saat sonra, desenin merkezi bölgesi boyunca hücre yapışma ve büyümesini gösterir. Enfekte hücrelerin çoğu, gradyan deseninin daha yüksek yoğunluklu merkezi bölgesi boyunca konumlandırılmıştır.
RSV varyantları, mikropatterned ızgaralarda yetişen enfekte BEAS-2B hücrelerinin çevresine yakın bir konumda bulunur. Tomogramlarda nükleapsid ve viral füzyon proteini de dahil olmak üzere birçok RSV yapısal proteini tanımlanmıştır. Mikropatterned ızgaralarda, pan-nöronal GFP ekspresyonlu Drosophila nöronları, floresan etiketleme ve mikropatternler içinde konumları nedeniyle ışık mikroskopisi ile kolayca takip edilebilir.
Kırılmamış ızgaralardaki nöronlar, ışık mikroskopisi ile GFP sinyali ile de izlenebilir. Bununla birlikte, hücresel döküntüler ve medyadan kaynaklanan kirlenme nedeniyle kriyo-elektron mikroskopisinde yer almak zorlaşır. Nöron hücre gövdesinin boyutları ve genişletilmiş nötritler nedeniyle, kriyo-elektron tomografi eğim serisi, hücrelerin daha ince bölgeleri boyunca daha yüksek büyütme ile toplanır.
Nöronal hücre zarı, mitokondri, mikrotübüller, aktüen filamentler, veziküler yapılar ve ribozomlar gibi makromoleküller, 3D tomogram boyunca daha yüksek büyütme görüntü montajlarında ve dilimlerinde iyi çözülür. Benzer hücre altı özellikler, 3D tomogramlardan, 3D tomogramlardan gözlenir. Kalıbın ızgaraya uygulanması ve PLPP jeline eklenmesi, desenleme sonuçlarını etkileyebilecek en hassas adımdır ve dikkatli yapılmalıdır.
Cryo-CLEM, cryo-ET veri toplama için hücrelerdeki ilgi çekici hedefleri yerelleştirmek için kullanılabilir. Cryo-FIB-SEM, veri toplama için çok kalın alanlardaki hücreleri inceltmek için kullanılabilir.
