Notre équipe de recherche développe des technologies et des protocoles pour la cryo-microscopie électronique et la cryo-tomographie électronique. Nous avons développé des protocoles pour le micromodèlement des grilles TEM afin de diriger la croissance cellulaire et le positionnement pour les expériences cryo-ET. La cryo-tomographie électronique à cellules entières est utilisée pour produire des structures de résolution de niveau nanométrique de complexes macromoléculaires dans des cellules préservées dans un état hydraté congelé natif.
Le micromodèlement peut augmenter le débit des expériences de cryo-ET-ET à cellules entières, de microscopie électronique à lumière cryo-corrélative et de fraisage par faisceau d’ions cryoconcentrés. Le nombre et la distribution des cellules sur les grilles EM sont cruciaux pour les études cryo-ET à cellules entières. Ce protocole fournit une méthode rapide, reproductible et largement adaptable pour diriger la croissance cellulaire sur les grilles EM par micromodélisme.
L’investigateur doit être à l’aise avec les pipettes, les pinces à épiler, les techniques de culture cellulaire de base et les microscopes électroniques à fluorescence et à transmission. Lorsque vous modélisez pour la première fois, utilisez un type de cellule bien connu et une combinaison ECM et testez-les sur des couvercles ou des plats MatTek. Les membres de l’équipe de recherche qui participent à l’élaboration de ce protocole sont : Dr.
Brian Sibert, M. Joseph Kim et le Dr Jae Yang. Pour commencer, transférez les grilles sur un support de préparation de grille et déchargez les grilles côté carbone vers le haut. Ensuite, transférez les grilles avec le côté carbone vers le haut vers une glissière en verre propre ou un couvercle avec une séparation d’au moins un centimètre entre les grilles.
Pipette 10 microlitres de 0,05 poly-L-lysine sur chaque grille et incuber les grilles dans une chambre humide pendant au moins 30 minutes. Après incubation, laver chaque grille trois fois avec 15 microlitres de 0,1 HEPES molaire à pH 8,5. Incuber la grille dans chaque lavage pendant 30 secondes, puis retirer la majeure partie du liquide de la grille avec une pipette sans laisser sécher la grille.
Après le lavage final, laissez chaque grille dans 15 microlitres de 0,1 HEPES molaire. Ensuite, préparez la solution PEG-SVA et remplacez immédiatement la solution HEPES sur les grilles par 10 microlitres de la solution PEG-SVA, puis incubez les grilles dans une chambre humide pendant au moins une heure. Après l’incubation, lavez chaque grille trois fois avec 15 microlitres d’eau stérile, en incubant la grille dans chaque lavage pendant 30 secondes.
Après le lavage final, laissez chaque grille dans 15 microlitres d’eau. Placez une goutte d’eau d’un microlitre au centre d’un nouveau couvercle propre, puis transférez soigneusement la grille de la goutte d’eau de 15 microlitres à la goutte sur le nouveau couvercle avec le côté carbone vers le haut. Ensuite, placez soigneusement le pochoir PDMS sur la grille en gardant la grille centrée et en minimisant le contact du pochoir avec la feuille de carbone de la grille.
Ajoutez ensuite un microlitre de gel PLPP sur la grille et pipettez doucement pour mélanger. Déplacez le couvercle avec la grille vers un endroit sombre pour sécher. Le gel séchera en 15 à 30 minutes.
Pour le micromodèlement, ouvrez le logiciel avec une vue en direct du champ lumineux du microscope. Pour concevoir un nouveau modèle pour une exécution initiale, sélectionnez Ajouter un retour sur investissement et choisissez un cercle de 3 000 micromètres. Positionnez le roi du cercle sur la grille en utilisant l’image Brightfield à l’écran comme guide, puis appuyez sur Verrouiller pour sécuriser le retour sur investissement.
Après avoir verrouillé le retour sur investissement en place, sélectionnez Ajouter un modèle et choisissez le modèle approprié. À l’aide des options de réplication, générez des copies du modèle initial pour créer une région carrée de grille huit sur huit. Ajustez l’espacement et l’angle si nécessaire pour aligner les motifs avec les carrés de la grille.
Placez le motif dans un coin de la grille. Ensuite, dupliquez le motif et placez une copie dans chacun des quatre coins de la grille en déplaçant l’étape du microscope si nécessaire pour chaque région. Utilisez les options de réplication pour modifier une région carrée de grille huit par huit en une région carrée de grille deux par huit à placer des deux côtés du centre.
Laissez les quatre carrés de la grille du centre sans motif. Pour chaque modèle, ajustez la dose totale si nécessaire. 30 millijoules par millimètre carré est un bon point de départ.
Sous Options expertes, ajustez l’angle, la position, l’espace entre et le rapport du motif pour affiner l’alignement du motif avec les carrés de la grille. Déplacez l’étage du microscope pour modifier la région de la grille dans l’écran Brightfield. Une fois le modèle et les modèles positionnés, décochez toutes les régions sauf une dans le panneau d’action du logiciel.
Utilisez l’étage du microscope pour naviguer vers cette région et vous concentrer sur la feuille de carbone. Cliquez sur l’icône du globe oculaire dans le panneau d’action pour désactiver l’affichage de la superposition de motifs. Une fois la grille mise au point, fermez l’obturateur Brightfield et appuyez sur l’icône Lecture dans le coin inférieur droit du logiciel pour commencer le processus de modelage, qui peut être surveillé en direct.
Répétez cette étape jusqu’à ce que toutes les régions soient modelées. Enfin, retirez le couvercle avec la grille du microscope et ajoutez immédiatement 10 microlitres de PBS stérile sur la grille. Après 10 minutes, retirez le pochoir avec une pince à épiler, puis lavez la grille trois fois avec 15 microlitres de PBS et laissez chaque grille dans PBS dans un endroit sombre.
Préparez 15 microlitres de la matrice extracellulaire pour chaque grille, puis remplacez le PBS de chaque grille par 15 microlitres de la matrice extracellulaire et incubez la grille dans une chambre humide pendant au moins une heure. Après l’incubation, lavez chaque grille cinq fois avec 15 microlitres de PBS stérile, comme démontré précédemment. Après le lavage final, laissez chaque grille dans PBS.
À l’aide d’un microscope à fluorescence, détectez le fluorophore dans la matrice extracellulaire pour confirmer le motif et que la feuille de carbone reste intacte. Les cellules HeLa ensemencées sur des grilles TEM micromoulus et non modélisées sont visibles par coloration fluorescente à l’aide d’un test de viabilité cellulaire à base de calcéine AM et d’homodimère-1 d’éthidium. En utilisant une matrice extracellulaire mixte de collagène et de fibrinogène, les cellules HeLa adhèrent facilement aux motifs à travers la grille.
La morphologie globale des cellules qui se sont développées le long du motif est similaire à celle des cellules cultivées sur des grilles non modelées. Une image en champ clair de cellules BEAS-2B infectées par le VRS 18 heures après l’ensemencement montre l’adhésion et la croissance des cellules le long de la région centrale du motif. La plupart des cellules infectées sont positionnées le long de la région centrale de densité plus élevée du modèle de gradient.
Les variantes du VRS sont situées près de la périphérie des cellules BEAS-2B infectées cultivées sur des grilles à micromotifs. De nombreuses protéines structurelles du VRS sont identifiées dans les tomogrammes, y compris la nucléocapside et la protéine de fusion virale. Sur des grilles à micromotifs, les neurones de la drosophile avec une expression pan-neuronale de GFP peuvent être facilement suivis par microscopie optique en raison du marquage fluorescent et de leur emplacement dans les micromotifs.
Les neurones sur des grilles non modelées peuvent également être suivis grâce à la signalisation GFP par microscopie optique. Cependant, les localiser en cryo-microscopie électronique devient difficile en raison des débris cellulaires et de la contamination par les milieux. En raison des dimensions du corps cellulaire des neurones et des neurites étendues, les séries d’inclinaison de cryo-tomographie électronique sont collectées le long de régions plus minces des cellules avec un grossissement plus élevé.
La membrane cellulaire neuronale, les mitochondries, les microtubules, les filaments d’actine, les structures vésiculeuses et les macromolécules telles que les ribosomes sont bien résolus dans des montages d’images à grossissement plus élevé et des tranches à travers le tomogramme 3D. Des caractéristiques subcellulaires similaires sont observées à partir de tomogrammes 3D de neurones non modelés. L’application du pochoir sur la grille et l’ajout du gel PLPP est l’étape la plus sensible qui peut affecter les résultats de modelage et doit être faite avec prudence.
Cryo-CLEM peut être utilisé pour localiser des cibles d’intérêt dans les cellules pour la collecte de données cryo-ET. Cryo-FIB-SEM peut être utilisé pour amincir des cellules sur des zones autrement trop épaisses pour la collecte de données.
