当社の研究チームは、クライオ電子顕微鏡とクライオ電子断層撮影の技術とプロトコルを開発しています。我々は、細胞増殖と位置決めをクライオ-ET実験に向けて、TEMグリッドをマイクロパターニングするためのプロトコルを開発した。全細胞クライオ電子断層撮影は、天然の凍結水和状態で保存された細胞内の高分子複合体のナノメートルレベルの分解能構造を作り出すために使用される。
マイクロパターニングは、全細胞クライオET、クライオ相関光電子顕微鏡、およびクライオに焦点を当てたイオンビームミリング実験のスループットを向上させることができます。EMグリッド上の細胞の数と分布は、全細胞クライオ-ET研究にとって極めて重要です。このプロトコルは、マイクロパターニングを通じてEMグリッド上の細胞増殖を指示するための迅速で、再現性があり、広く適応可能な方法を提供します。
研究者は、ピペット、ピンセット、基本的な細胞培養技術、および蛍光および透過電子顕微鏡を使用して快適であるべきです。初めてパターニングするときは、よく知られた細胞タイプとECMの組み合わせを使用し、カバーリップやMatTek料理でそれらをテストします。このプロトコル開発に携わる研究チームのメンバーは、以下の例を参照してください。
ブライアン・シバート、ジョセフ・キム氏、ジェ・ヤン博士まず、グリッドをグリッド準備ホルダーに転送し、グリッドのカーボンサイドをグロー放電します。次に、カーボン側のグリッドを、グリッド間の少なくとも1センチメートルの分離を持つきれいなガラススライドまたはカバースリップまで転送します。
ピペット10マイクロリットルの0.05ポリL-リジンを各グリッドに加え、湿度の高いチャンバー内で30分以上インキュベートします。インキュベーション後、各グリッドをpH 8.5で0.1モルHEPESの15マイクロリットルで3回洗浄します。各洗浄でグリッドを30秒間インキュベートし、グリッドを乾燥させることなくピペットでグリッドから液体のほとんどを取り除きます。
最終洗浄後、各グリッドを15マイクロリットルの0.1モルHEPESに残します。次に、PEG-SVA溶液を調製し、すぐに10マイクロリットルのPEG-SVA溶液でグリッド上のHEPES溶液を交換し、その後、少なくとも1時間、湿度の高いチャンバー内のグリッドをインキュベートします。インキュベーション後、各グリッドを15マイクロリットルの無菌水で3回洗浄し、各洗浄でグリッドを30秒間インキュベートします。
最後の洗浄後、各グリッドを15マイクロリットルの水に残します。新しいきれいなカバースリップの中央に1マイクロリットルの水滴を置き、15マイクロリットルの水滴から炭素側を上にして新しいカバースリップのドロップにグリッドを慎重に移します。次に、グリッドの中央を維持し、グリッドのカーボン箔とのステンシル接触を最小限に抑えるグリッド上にPDMSステンシルに慎重に配置します。
その後、PLPPゲルの1マイクロリットルをグリッドに加え、ピペットをそっと混ぜます。グリッド付きのカバースリップを暗い場所に移動して乾燥させます。ゲルは15〜30分で乾燥します。
マイクロパターン化の場合は、マイクロスコープからライブブライトフィールドビューでソフトウェアを開きます。初回実行用の新しいテンプレートを設計するには、[ROI を追加]を選択し、3,000 マイクロメートル円を選択します。画面上のブライトフィールド画像をガイドとしてグリッド上に円ROIを配置し、ロックを押してROIを固定します。
ROI を所定の位置にロックしたら、[パターンを追加]を選択して、適切なパターンを選択します。レプリケーション オプションを使用して、初期パターンのコピーを生成して、8 つ 1 つ 1 つのグリッド四角形リージョンを作成します。必要に応じて間隔と角度を調整して、パターンをグリッドの正方形に揃えます。
グリッドの一角にパターンを配置します。次に、パターンを複製し、必要に応じて各領域に対して顕微鏡ステージを移動するグリッドの四隅のそれぞれにコピーを配置する。レプリケーション オプションを使用して、8 % 8 グリッド四角形の領域を、中心の両側に配置する 2 % 8 のグリッド正方形リージョンに変更します。
中央の 4 つのグリッドの正方形をパターン化したままにします。各パターンについて、必要に応じて総投与量を調整します。1平方ミリメートルあたり30ミリジュールは良い出発点です。
[エキスパート オプション] で、パターンの角度、位置、間隔、および比率を反復して調整し、パターンの配置をグリッドの正方形に調整します。顕微鏡ステージを動かして、ブライトフィールドディスプレイのグリッド領域を変更します。テンプレートとパターンを配置したら、ソフトウェアのアクションパネルで、いずれかの領域を除くすべての領域のチェックを外します。
顕微鏡ステージを使用して、その領域に移動し、炭素箔に焦点を当てます。アクションパネルの眼球アイコンをクリックして、パターンオーバーレイの表示をオフに切り替えます。グリッドにフォーカスが合った後、ブライトフィールドシャッターを閉じ、ソフトウェアの右下隅にある再生アイコンを押して、ライブで監視できるパターニングプロセスを開始します。
すべての領域がパターン化されるまで、この手順を繰り返します。最後に、グリッドを使用してカバースリップを取り外し、すぐに10マイクロリットルの無菌PBSをグリッドに追加します。10分後、ピンセットでステンシルを取り出し、15マイクロリットルのPBSでグリッドを3回洗い、各グリッドをPBSの暗い場所に残します。
各グリッドに対して15マイクロリットルの細胞外マトリックスを用意し、各グリッドのPBSを細胞外マトリックスの15マイクロリットルに置き換え、少なくとも1時間は湿度の高いチャンバーでグリッドをインキュベートします。インキュベーション後、前に示したように、各グリッドを15マイクロリットルの無菌PBSで5回洗浄します。最後の洗浄後、各グリッドをPBSに残します。
蛍光顕微鏡を用いて、細胞外マトリックス中の蛍光素を検出して、パターン化を確認し、炭素箔がそのまま残っていることを確認します。マイクロパターン化および未パターンのTEMグリッドに播種されたHeLa細胞は、カルセインAMおよびエチジウムホモジマー-1ベースの細胞生存アッセイを使用した蛍光染色によって見える。混合コラーゲンとフィブリノーゲン細胞外マトリックスを使用して、HeLa細胞はグリッド全体のパターンに容易に付着する。
パターンに沿って拡大した細胞の全体的な形態は、パターン化されていないグリッド上で増殖した細胞の形態に似ています。播種後18時間でRSV感染BEAS-2B細胞のブライトフィールド画像は、パターンの中央領域に沿って細胞の接着および成長を示す。感染細胞の大部分は、勾配パターンの高密度中央領域に沿って配置されます。
RSV変異体は、微量パターン化された格子上で増殖した感染したBEAS-2B細胞の周辺の近くに位置する。多くのRSV構造タンパク質は、ヌクレオキャプシドおよびウイルス融合タンパク質を含むトモグラム内で同定される。微小パターン化されたグリッドでは、汎神経細胞GFP発現を有するショウジョウバエニューロンは、蛍光標識とその位置がマイクロパターン内にあるため、光顕微鏡検査によって容易に追跡することができる。
パターン化されていないグリッド上のニューロンは、光顕微鏡によるGFPシグナリングを介して追跡することもできます。しかし、細胞の破片や媒体からの汚染のために、それらをクライオ電子顕微鏡で見つけることは困難になります。ニューロン細胞体と拡張神経突起の寸法により、高倍率の細胞のより薄い領域に沿ってクライオ電子断層撮影傾斜系列が収集されます。
ニューロン細胞膜、ミトコンドリア、微小管、アクチンフィラメント、小胞構造、リボソームなどの高分子は、3Dトモグラムを介して高倍率の画像モンタージュおよびスライスでよく解決されます。同様の細胞下の特徴は、パターン化されていないニューロンの3D断食から観察される。グリッドにステンシルを適用し、PLPP ゲルに追加することは、パターニング結果に影響を与える可能性がある最も機密性の高い手順であり、注意して行う必要があります。
Cryo-CLEMは、細胞内の対象をクライオ-ETデータ収集のためにローカライズするために使用できます。Cryo-FIB-SEMは、データ収集のために厚すぎる領域のセルを薄くするために使用することができます。
