يقوم فريق البحث لدينا بتطوير تقنيات وبروتوكولات للمجهر الإلكتروني المبرد والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. لقد طورنا بروتوكولات لشبكات TEM ذات النمط الدقيق لتوجيه نمو الخلايا وتحديد المواقع لتجارب cryo-ET. يستخدم التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون كامل الخلية لإنتاج هياكل دقة على مستوى النانومتر للمجمعات الجزيئية الكبيرة داخل الخلايا المحفوظة في حالة رطبة مجمدة أصلية.
يمكن أن يزيد النمط الدقيق من إنتاجية CRYO-ET للخلية الكاملة ، والمجهر الإلكتروني الخفيف المرتبط بالتبريد ، وتجارب طحن الحزمة الأيونية التي تركز على التبريد. يعد عدد الخلايا وتوزيعها على شبكات EM أمرا بالغ الأهمية لدراسات cryo-ET كاملة الخلايا. يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وقابلة للتكرار وقابلة للتكيف على نطاق واسع لتوجيه نمو الخلايا على شبكات EM من خلال النمط المصغر.
يجب أن يكون الباحث مرتاحا لاستخدام الماصات والملاقط وتقنيات زراعة الخلايا الأساسية والمجاهر الإلكترونية الفلورية والإرسال. عند النقش لأول مرة ، استخدم مجموعة معروفة من الخلايا و ECM واختبرها على أغطية أو أطباق MatTek. أعضاء فريق البحث المشاركين في تطوير هذا البروتوكول هم: الدكتور.
براين سيبرت والسيد جوزيف كيم والدكتور جاي يانغ. للبدء ، انقل الشبكات إلى حامل إعداد الشبكة وقم بتفريغ جانب الكربون للشبكات لأعلى. بعد ذلك ، انقل الشبكات ذات الجانب الكربوني إلى شريحة زجاجية نظيفة أو غطاء مع فصل سنتيمتر واحد على الأقل بين الشبكات.
ماصة 10 ميكرولترات من 0.05 بولي L-ليسين على كل شبكة واحتضان الشبكات في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد الحضانة ، اغسل كل شبكة ثلاث مرات ب 15 ميكرولتر من 0.1 HEPES مولي عند درجة الحموضة 8.5. احتضن الشبكة في كل غسلة لمدة 30 ثانية ، ثم قم بإزالة معظم السائل من الشبكة باستخدام ماصة دون ترك الشبكة تجف.
بعد الغسيل النهائي ، اترك كل شبكة في 15 ميكرولتر من 0.1 HEPES المولي. بعد ذلك ، قم بإعداد حل PEG-SVA واستبدل على الفور حل HEPES على الشبكات ب 10 ميكرولترات من محلول PEG-SVA ، ثم احتضن الشبكات في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الحضانة ، اغسل كل شبكة ثلاث مرات ب 15 ميكرولتر من الماء المعقم ، مع احتضان الشبكة في كل غسلة لمدة 30 ثانية.
بعد الغسيل النهائي ، اترك كل شبكة في 15 ميكرولتر من الماء. ضع قطرة ماء ميكرولتر واحدة في وسط غطاء نظيف جديد ، ثم انقل الشبكة بعناية من قطرة الماء 15 ميكرولتر إلى القطرة الموجودة على الغطاء الجديد مع جانب الكربون لأعلى. بعد ذلك ، ضع استنسل PDMS بعناية فوق الشبكة مع الحفاظ على تمركز الشبكة وتقليل ملامسة الاستنسل لرقائق الكربون في الشبكة.
ثم أضف ميكرولتر واحد من جل PLPP على الشبكة وماصة بلطف للخلط. حرك زلة الغطاء مع الشبكة إلى مكان مظلم لتجف. سوف يجف الجل في غضون 15 إلى 30 دقيقة.
بالنسبة للأنماط الدقيقة ، افتح البرنامج من خلال عرض برايتفيلد المباشر من المجهر. لتصميم قالب جديد لتشغيل أولي، حدد إضافة عائد استثمار واختر دائرة 3000 ميكرومتر. ضع عائد استثمار الدائرة فوق الشبكة باستخدام صورة Brightfield على الشاشة كدليل، ثم اضغط على Lock لتأمين عائد الاستثمار.
بعد تأمين عائد الاستثمار في مكانه، حدد إضافة نمط واختر النمط المناسب. باستخدام خيارات النسخ المتماثل، قم بإنشاء نسخ من النمط الأولي لإنشاء منطقة مربعة شبكة ثمانية في ثمانية. اضبط التباعد والزاوية حسب الضرورة لمحاذاة الأنماط مع مربعات الشبكة.
ضع النمط في زاوية واحدة من الشبكة. بعد ذلك ، كرر النمط وضع نسخة في كل زاوية من الزوايا الأربع للشبكة التي تحرك مرحلة المجهر حسب الضرورة لكل منطقة. استخدم خيارات النسخ المتماثل لتعديل منطقة مربعة شبكة ثمانية في ثمانية إلى منطقة مربعة شبكة اثنين في ثمانية ليتم وضعها على جانبي المركز.
اترك مربعات الشبكة الأربعة المركزية دون نمط. لكل نمط ، اضبط الجرعة الإجمالية إذا لزم الأمر. 30 ملليجول لكل ملليمتر مربع هي نقطة انطلاق جيدة.
ضمن خيارات الخبراء، كرر ضبط زاوية النمط وموضعه والمسافة بينه ونسبته لتحسين محاذاة النمط مع مربعات الشبكة. حرك مرحلة المجهر لتغيير منطقة الشبكة في شاشة Brightfield. بمجرد وضع القالب والأنماط ، قم بإلغاء تحديد جميع المناطق باستثناء منطقة واحدة في لوحة العمل الخاصة بالبرنامج.
استخدم مرحلة المجهر للانتقال إلى تلك المنطقة والتركيز على رقائق الكربون. انقر على أيقونة مقلة العين في لوحة الحركة لتبديل شاشة تراكب الحشو. بمجرد أن تصبح الشبكة في بؤرة التركيز ، أغلق مصراع Brightfield واضغط على أيقونة Play في الزاوية اليمنى السفلى من البرنامج لبدء عملية النقش ، والتي يمكن مراقبتها مباشرة.
كرر هذه الخطوة حتى يتم نقش كافة المناطق. أخيرا ، قم بإزالة الغطاء مع الشبكة من المجهر وأضف على الفور 10 ميكرولترات من PBS المعقمة إلى الشبكة. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة الاستنسل باستخدام ملاقط ، ثم اغسل الشبكة ثلاث مرات باستخدام 15 ميكرولتر من PBS واترك كل شبكة في PBS في مكان مظلم.
قم بإعداد 15 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية لكل شبكة ، ثم استبدل PBS من كل شبكة ب 15 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية واحتضن الشبكة في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الحضانة ، اغسل كل شبكة خمس مرات ب 15 ميكرولتر من PBS المعقم كما هو موضح سابقا. بعد الغسيل النهائي ، اترك كل شبكة في PBS.
باستخدام المجهر الفلوري ، اكتشف الفلوروفور في المصفوفة خارج الخلية لتأكيد النقش وأن رقائق الكربون لا تزال سليمة. خلايا HeLa المزروعة على شبكات TEM ذات النمط الدقيق وغير المتناثر مرئية عن طريق تلطيخ الفلورسنت باستخدام فحص صلاحية الخلايا القائمة على calcein AM و ethidium homodimer-1. باستخدام مصفوفة مختلطة من الكولاجين والفيبرينوجين خارج الخلية ، تلتصق خلايا HeLa بسهولة بالأنماط عبر الشبكة.
التشكل العام للخلايا التي توسعت على طول النمط يشبه مورفولوجيا الخلايا المزروعة على شبكات غير متناثرة. تظهر صورة برايتفيلد لخلايا BEAS-2B المصابة بفيروس RSV بعد 18 ساعة من البذر التصاق الخلايا ونموها على طول المنطقة الوسطى من النمط. يتم وضع معظم الخلايا المصابة على طول المنطقة الوسطى ذات الكثافة العالية من نمط التدرج.
تقع متغيرات RSV بالقرب من محيط خلايا BEAS-2B المصابة المزروعة على شبكات ذات أنماط دقيقة. يتم تحديد العديد من البروتينات الهيكلية RSV داخل التصوير المقطعي ، بما في ذلك nucleocapsid وبروتين الاندماج الفيروسي. على الشبكات ذات الأنماط الدقيقة ، يمكن تتبع الخلايا العصبية لذبابة الفاكهة ذات تعبير GFP العصبي الشامل بسهولة عن طريق المجهر الضوئي بسبب وضع العلامات الفلورية وموقعها داخل الأنماط الدقيقة.
يمكن أيضا تتبع الخلايا العصبية على الشبكات غير المتناثرة من خلال إشارات GFP بواسطة المجهر الضوئي. ومع ذلك ، يصبح تحديد موقعها في المجهر الإلكتروني المبرد أمرا صعبا بسبب الحطام الخلوي والتلوث من الوسائط. نظرا لأبعاد جسم الخلية العصبية والعصبيات الممتدة ، يتم جمع سلسلة إمالة التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون على طول المناطق الأرق من الخلايا ذات التكبير العالي.
يتم حل غشاء الخلية العصبية ، الميتوكوندريا ، الأنابيب الدقيقة ، خيوط الأكتين ، الهياكل الحويصلية ، والجزيئات الكبيرة مثل الريبوسومات بشكل جيد في مونتاج صور التكبير العالي والشرائح من خلال التصوير المقطعي 3D. لوحظت ميزات تحت خلوية مماثلة من التصوير المقطعي 3D للخلايا العصبية غير المتناثرة. يعد تطبيق الاستنسل على الشبكة وإضافته على هلام PLPP الخطوة الأكثر حساسية التي يمكن أن تؤثر على نتائج النقش ويجب القيام بها بحذر.
يمكن استخدام Cryo-CLEM لتوطين الأهداف ذات الأهمية داخل الخلايا لجمع بيانات cryo-ET. يمكن استخدام Cryo-FIB-SEM لترقق الخلايا في المناطق السميكة جدا لجمع البيانات.
