分析EGFR突变型NSCLC患者衍生类器官靶向治疗的敏感性

该协议非常重要，因为成功使用类器官在于细节，并且该领域缺少明确详细的协议供其他人构建。该技术的最大优点是时间尺度，低生物质要求和低成本可扩展性。虽然还需要更多的工作，但这种技术可以通过允许测试更精确的个体或联合疗法来帮助改善肺癌治疗，这些疗法可以在临床上转化。

最大的挑战是处理BME2，广为人知的Matrigel。我强烈建议在介绍您珍贵的类器官之前练习移液和处理液体BME2。首先通过小心地从培养板中吸取培养基，避免接触培养物，从而解离淹没的BME2类器官培养物。

通过在六孔板中每孔添加两毫升重组酶，用合适的重组酶对浸没的BME2类器官培养物进行胰蛋白酶消化。通过反复上下移液并在细胞培养箱中以37摄氏度孵育板5分钟，机械地破坏BME2。在孵育结束时，将悬浮液转移到15毫升离心管中，并在室温下以600倍G离心5分钟。

小心地吸出重组酶上清液而不接触类器官沉淀，并将类器官沉淀重悬于生长培养基中。加入DNase 1后，在室温下孵育悬浮液五分钟，并在室温下以600倍G离心三分钟。小心地丢弃培养基，不要接触类器官沉淀，并将沉淀重悬于新鲜的生长培养基中。

在细胞培养箱中以37摄氏度预热新的黑色透明底部96孔板10分钟，然后在PBS中制备细胞悬浮液以使用细胞分析仪计数细胞。在计算实验所需的细胞悬浮体积后，如前所述，将来自单细胞悬浮液的细胞等分，并通过离心将沉淀向下。一旦培养基被丢弃，将细胞在冰上保持约一分钟，然后在BME2中重复使用。

将预热的黑色透明底部96孔板向身体倾斜，每孔播种五微升细胞悬浮液，然后在孔的六点位置接种细胞圆顶。用PBS填充96孔板边缘的外孔，并将细胞圆顶接种在剩余的内孔中。在不移动板的情况下，将新接种的细胞圆顶在细胞培养层流罩中孵育5分钟，然后将板转移到细胞培养箱中，在37摄氏度下孵育10分钟。

小心地将每孔100微升生长培养基加入所有含有类器官的孔中，并将100微升PBS添加到板边缘的外孔中。在37摄氏度下培养类器官七天，按照文本手稿中提到的指示更换培养基，定期在光学显微镜下检查类器官的生长。在低生长因子培养基中制备连续药物稀释液，用于osimertinib治疗EGFR突变的非小细胞肺癌类器官。

通过添加低生长因子培养基和 0.1% DMSO 来包括阴性对照。顺时针旋转类器官板180度，使类器官现在处于12点钟位置，并且最好使用多通道装置小心地吸出生长培养基。每孔加入100微升对照或药物溶液。

将处理过的类器官在37摄氏度下再次在细胞培养箱中孵育五天。通过在四摄氏度下解冻试剂过夜开始进行生存测定。使用前将试剂在室温下在水浴中平衡30分钟，并通过倒置混合。

向每个孔中加入100微升试剂，并通过上下移液将移液器尖端置于类器官圆顶的位置进行彻底混合。在室温下在黑暗中孵育五分钟。使用多通道移液器，将约150微升的裂解物转移到新的白色不透明底部96孔板中，然后在室温下在黑暗中将板再孵育25分钟。

使用ELISA板读取器记录发光。以适当的数据表格式保存数据，其中包含板布局和所用药物的所有原始读取和记录。EGFR突变阳性TH107类器官对最大抑制浓度为56纳摩尔的osimertinib治疗敏感，而EGFR突变阳性TH116类器官对osimertinib治疗具有抗药性，半最大抑制浓度大于1微摩尔。

EGFR阳性TH107非小细胞肺癌细胞的敏感性伴随着显着的转录变化，包括细胞周期相关基因特征表达的减少和细胞凋亡相关基因特征表达的增加。与低生长因子培养基相比，敏感的EGFR突变阳性TH330对靶向抑制剂的反应在生长培养基中受到显着影响。EGFR突变阳性 TH330 的组合治疗导致治疗反应增加。

这种方法改善了分子治疗或组合治疗方案的个性化策略。后者有助于早期靶向药物耐受性和耐药机制，以深化临床反应并改善患者预后。