Este protocolo es importante porque trabajar con éxito con organoides radica en los detalles, y al campo le faltan protocolos detallados claros para que otros construyan. La mayor ventaja de esta técnica es la escala de tiempo, los bajos requisitos de biomasa y la escalabilidad de bajo costo. Si bien se necesita mucho más trabajo, esta técnica podría ayudar a mejorar el tratamiento del cáncer de pulmón al permitir la prueba de terapias individuales o combinadas más precisas que podrían traducirse clínicamente.
El mayor desafío es con el manejo de BME2, ampliamente conocido como Matrigel. Recomiendo encarecidamente practicar pipeteo y manipular BME2 líquido antes de introducir sus preciosos organoides. Comience disociando el cultivo organoide BME2 sumergido aspirando cuidadosamente los medios de las placas de cultivo evitando tocar el cultivo.
Tripsinizar el cultivo de organoides BME2 sumergido con una enzima recombinante adecuada mediante la adición de dos mililitros de enzima recombinante por pozo en una placa de seis pocillos. Rompa mecánicamente el BME2 canalizando repetidamente hacia arriba y hacia abajo e incube placas a 37 grados Celsius en la incubadora de cultivo celular durante cinco minutos. Al final de la incubación, transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrífuga a 600 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Aspire la enzima recombinante sobrenadante con cuidado sin tocar el gránulo organoide y resuspenda el gránulo organoide en el medio de crecimiento. Después de agregar DNasa 1, incube la suspensión durante cinco minutos a temperatura ambiente y centrífuga a 600 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Deseche el medio cuidadosamente sin tocar el gránulo organoide y vuelva a suspender el gránulo en un medio de crecimiento fresco.
Precaliente una nueva placa negra transparente de 96 pocillos a 37 grados Celsius en la incubadora de cultivo celular durante 10 minutos, luego prepare una suspensión celular en PBS para contar las células usando un analizador celular. Después de calcular el volumen de suspensión celular requerido para el experimento, alícuota las células de la suspensión unicelular y el pellet hacia abajo por centrifugación como se demostró anteriormente. Una vez que se desecha el medio, mantenga las células en hielo durante aproximadamente un minuto antes de volver a suusptar en BME2.
Incline la placa de pozo inferior transparente negra precalentada hacia el cuerpo y siembre cinco microlitros de suspensión celular por pozo, seguido de sembrar las cúpulas celulares en la posición de las seis en punto del pozo. Llene los pozos exteriores en el borde de la placa de 96 pocillos con PBS y siembre las cúpulas celulares en los pozos internos restantes. Incubar cúpulas celulares recién sembradas en la campana de flujo laminar de cultivo celular durante cinco minutos sin mover la placa, luego transferir la placa a la incubadora de cultivo celular para incubación a 37 grados Celsius durante 10 minutos.
Agregue cuidadosamente 100 microlitros de medio de crecimiento por pozo a todos los pozos que contienen organoides y 100 microlitros de PBS a los pozos exteriores en el borde de la placa. Cultive los organoides a 37 grados centígrados durante siete días, cambie los medios según las instrucciones mencionadas en el manuscrito del texto, inspeccione el crecimiento de los organoides bajo el microscopio de luz regularmente. Preparar una dilución seriada del fármaco en medios de bajo factor de crecimiento para osimertinib para tratar los organoides de cáncer de pulmón de células no pequeñas mutantes DE EGFR.
Incluya un control negativo agregando medios de bajo factor de crecimiento y 0.1% DMSO. Gire la placa organoide en el sentido de las agujas del reloj en 180 grados, de modo que los organoides ahora estén en la posición de las 12 en punto y aspire cuidadosamente los medios de crecimiento utilizando un aparato multicanal preferiblemente. Agregue 100 microlitros de control o solución de medicamento por pozo.
Incubar organoides tratados de nuevo a 37 grados centígrados en la incubadora de cultivo celular durante cinco días. Comience a realizar el ensayo de supervivencia descongelando el reactivo durante la noche a cuatro grados centígrados. Equilibre el reactivo en un baño de agua a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlo y mezcle invirtiendo.
Agregue 100 microlitros del reactivo a cada pozo y mezcle bien canalizando hacia arriba y hacia abajo con la punta de la pipeta colocada en la posición de la cúpula organoide. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Usando una pipeta multicanal, transfiera aproximadamente 150 microlitros del lisado a una nueva placa blanca opaca inferior de 96 pocillos y luego incube la placa durante 25 minutos adicionales a temperatura ambiente en la oscuridad.
Registre la luminiscencia utilizando un lector de placas ELISA. Guarde los datos en un formato de tabla de datos apropiado que contenga todas las lecturas y grabaciones en bruto del diseño de la placa y los medicamentos utilizados. Los organoides TH107 positivos con mutación EGFR mostraron sensibilidad al tratamiento con osimertinib con una concentración inhibitoria máxima de 56 nanomolares, mientras que los organoides TH116 positivos con mutación EGFR fueron resistentes al tratamiento con osimertinib con una concentración inhibitoria máxima de la mitad de más de un micromolar.
La sensibilidad de las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas TH107 positivas para EGFR se acompañó de cambios transcripcionales significativos, incluida una reducción en la expresión de las firmas genéticas asociadas al ciclo celular y un aumento en la expresión de la firma génica asociada a la apoptosis. La respuesta de TH330 positivo con mutación EGFR sensible a los inhibidores dirigidos se ve afectada significativamente en los medios de crecimiento frente a los medios de bajo factor de crecimiento. Los tratamientos combinatorios en TH330 positivo con mutación EGFR dieron lugar a un aumento de la respuesta al tratamiento.
Este enfoque mejora las estrategias personalizadas para la terapia molecular o los regímenes de tratamiento combinatorio. Este último ayuda a atacar los mecanismos de tolerancia y resistencia a los medicamentos de manera temprana para profundizar la respuesta clínica y mejorar los resultados de los pacientes.
