Questo protocollo è significativo perché lavorare con successo con gli organoidi risiede nei dettagli e nel campo mancano protocolli chiari e dettagliati da cui altri possano costruire. Il più grande vantaggio di questa tecnica è la tempistica, i bassi requisiti di biomassa e la scalabilità a basso costo. Mentre è necessario molto più lavoro, questa tecnica potrebbe aiutare a migliorare il trattamento del cancro del polmone consentendo la sperimentazione di terapie individuali o combinate più precise che potrebbero essere tradotte clinicamente.
La sfida più grande è con la gestione di BME2, ampiamente noto come Matrigel. Consiglio vivamente di praticare il pipettaggio e la manipolazione del BME2 liquido prima di introdurre i tuoi preziosi organoidi. Inizia dissociando la coltura di organoidi BME2 sommersi aspirando attentamente i media dalle piastre di coltura evitando di toccare la cultura.
Tripsinizzare la coltura organoide BME2 sommersa con un enzima ricombinante adatto aggiungendo due millilitri di enzima ricombinante per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Rompere meccanicamente il BME2 pipettando ripetutamente su e giù e incubare le piastre a 37 gradi Celsius nell'incubatore di colture cellulari per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire la sospensione in un tubo centrifugo da 15 millilitri e centrifuga a 600 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aspirare accuratamente l'enzima surnatante ricombinante senza toccare il pellet organoide e risospesare il pellet organoide nel mezzo di crescita. Dopo aver aggiunto DNasi 1, incubare la sospensione per cinque minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 600 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Scartare accuratamente il mezzo senza toccare il pellet organoide e risospesciare il pellet in un terreno di crescita fresco.
Preriscaldare una nuova piastra nera trasparente da 96 pozzetti a 37 gradi Celsius nell'incubatore di colture cellulari per 10 minuti, quindi preparare una sospensione cellulare in PBS per contare le cellule utilizzando un analizzatore cellulare. Dopo aver calcolato il volume di sospensione cellulare richiesto per l'esperimento, aliquotare le cellule dalla sospensione monocellulare e dal pellet verso il basso mediante centrifugazione, come dimostrato in precedenza. Una volta che il supporto viene scartato, mantenere le cellule sul ghiaccio per circa un minuto prima di riesegnare in BME2.
Inclinare la piastra del pozzo 96 inferiore nero preriscaldato verso il corpo e seminare cinque microlitri di sospensione cellulare per pozzetto, seguita dalla semina delle cupole cellulari nella posizione a ore sei del pozzo. Riempire i pozzetti esterni sul bordo della piastra del pozzo 96 con PBS e seminare le cupole cellulari nei restanti pozzetti interni. Incubare le cupole cellulari appena seminate nella cappa a flusso laminare della coltura cellulare per cinque minuti senza spostare la piastra, quindi trasferire la piastra nell'incubatore di colture cellulari per l'incubazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Aggiungere con attenzione 100 microlitri di terreno di coltura per pozzetto a tutti i pozzetti contenenti organoidi e 100 microlitri di PBS ai pozzetti esterni sul bordo della piastra. Coltivare gli organoidi a 37 gradi Celsius per sette giorni, cambiando i mezzi secondo le indicazioni menzionate nel manoscritto di testo, ispezionando regolarmente la crescita degli organoidi al microscopio ottico. Preparare una diluizione seriale del farmaco in mezzi a basso fattore di crescita per osimertinib per il trattamento di organoidi del carcinoma polmonare non a piccole cellule mutanti EGFR.
Includere un controllo negativo aggiungendo media a basso fattore di crescita e 0,1% DMSO. Ruotare la piastra organoide in senso orario di 180 gradi in modo tale che gli organoidi ora siano in posizione a ore 12 e aspirare accuratamente i mezzi di crescita utilizzando preferibilmente un apparato multicanale. Aggiungere 100 microlitri di controllo o soluzione farmacologica per pozzetto.
Incubare nuovamente gli organoidi trattati a 37 gradi Celsius nell'incubatore di colture cellulari per cinque giorni. Iniziare a eseguire il test di sopravvivenza scongelando il reagente durante la notte a quattro gradi Celsius. Equilibrare il reagente a bagnomaria a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso e mescolare invertendo.
Aggiungere 100 microlitri del reagente a ciascun pozzetto e mescolare accuratamente pipettando su e giù con la punta della pipetta posta nella posizione della cupola dell'organoide. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente al buio. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire circa 150 microlitri del lisato su una nuova piastra bianca opaca del fondo 96 e quindi incubare la piastra per altri 25 minuti a temperatura ambiente al buio.
Registra la luminescenza utilizzando un lettore di piastre ELISA. Salvare i dati in un formato di tabella dati appropriato contenente tutte le letture e le registrazioni grezze del layout della piastra e dei farmaci utilizzati. Gli organoidi TH107 EGFR-mutanti positivi hanno mostrato sensibilità al trattamento con osimertinib con una concentrazione inibitoria semi-massima di 56 nanomolari mentre gli organoidi TH116 positivi a EGFR-mutanti erano resistenti al trattamento con osimertinib con una concentrazione inibitoria semi-massima superiore a un micromolare.
La sensibilità delle cellule tumorali polmonari a piccole cellule TH107 EGFR-positive è stata accompagnata da significativi cambiamenti trascrizionali, tra cui una riduzione dell'espressione delle firme geniche associate al ciclo cellulare e un aumento dell'espressione della firma genica associata all'apoptosi. La risposta del sensibile TH330 positivo mutazione EGFR agli inibitori mirati è significativamente influenzata nei mezzi di crescita rispetto ai mezzi a basso fattore di crescita. I trattamenti combinatori in EGFR-mutante positivo TH330 hanno determinato un aumento della risposta al trattamento.
Questo approccio migliora le strategie personalizzate per la terapia molecolare o i regimi di trattamento combinatorio. Quest'ultimo aiuta a indirizzare precocemente i meccanismi di tolleranza e resistenza ai farmaci per approfondire la risposta clinica e migliorare i risultati dei pazienti.
