人类患者来源的类器官是三维体外模型系统，代表患者多样性和肿瘤的细胞异质性。该协议和视频演示为建立患者来源的乳腺肿瘤和正常类器官提供了详细的实践指南。患者来源的乳腺肿瘤类器官是令人兴奋的新模型，但很难建立。
我们在这里提供的综合方案应该有助于研究人员为尝试开发乳腺类器官的研究人员做好准备，并让他们熟悉预期的挑战。来自不同患者的每个PDO系在形态和生长速度上都是独一无二的。与两个2D细胞系系统不同，类器官在高密度接种时生长得更好，从而实现更好的细胞间相互作用。
演示该程序的将是我实验室的研究生Disha Aggarwal。首先，在冰上解冻一瓶地下室膜基质或在四摄氏度下过夜。将切除的组织转移到10厘米的无菌培养皿中。
肉眼检查组织，并注意其形态上是否有脂肪、血管化或坏死。此外，记录组织的大小和形状，并用尺子拍摄组织的照片。用无菌10号手术刀将组织切成小块，然后将其转移到50毫升的锥形管中。
加入10毫升每毫升2毫克的胶原酶IV溶液并密封试管。将试管放在 37 摄氏度、140 RPM 的轨道摇床上，以 30 度角放置 30 至 90 分钟。在孵育过程中，将等分试样的完全培养基置于37摄氏度的珠子或水浴中预热。
每 15 分钟，使用 5 毫升无菌预包被血清移液管上下剧烈混合，重新悬浮组织。通过在显微镜下以5X或更高的放大倍率观察管来监测随时间推移的解离。一旦组织解离，以400G离心五分钟，吸出上清液，并加入10毫升AdDF +再次离心并小心吸出上清液，因为组织沉淀偶尔会松散。
如果组织沉淀部分呈红色，则加入两毫升红细胞裂解缓冲液，并在室温下孵育五分钟。孵育后，向管中加入10毫升AdDF +，以400G离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于50至300微升未稀释的冷基底膜基质中，并通过仔细移液混合以避免形成气泡。
使用在培养箱中预热过夜的六孔组织培养板，在每个孔中板300微升含有类器官的基底膜基质圆顶。将板在引擎盖中不受干扰五分钟，然后将其置于 37 摄氏度下 20 到 30 分钟，以使基底膜基质圆顶完全凝固。孵育结束时，向每个孔中滴加三毫升预热的完全培养基，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。
孵育后，在倒置明场显微镜上使用5X物镜捕获类器官的图像。使用细胞刮刀或一毫升移液器吸头将基底膜基质圆顶提升到孔中的培养基中。使用预包被的移液器吸头，根据收获的孔数，将带有培养基的类器官的浮动圆顶转移到 15 或 50 毫升的锥形管中。
然后加入DPBS将体积增加到至少五毫升。以 400 G 离心管五分钟。带有类器官的基底膜基质在底部形成一层。
吸出上清液后，根据管中汇集的孔数，加入5至20毫升DPBS。使用预包被的无菌一次性移液管在DBPS中混合类器官基底膜基质沉淀。再次，离心并丢弃上清液。
使用包被的移液器吸头，以基底膜基质体积的三倍加入细胞解离试剂，并重悬类器官。将试管放在 37 摄氏度、140 RPM 的轨道摇床上，以倾斜位置放置 8 至 15 分钟。每五分钟在显微镜下观察一次管子，以确保类器官被分解成更小的簇。
以等于或大于细胞解离试剂和移液管的体积加入AdDF+以混合类器官。以400 G离心五分钟以获得类器官沉淀。一旦获得没有未溶解的基底膜基质的白色类器官沉淀，丢弃上清液并将沉淀重悬于一毫升AdDF +中，用AdDF+将体积补足至10毫升旋转管进行洗涤步骤并弃去上清液。
根据适当的分流比将所需量的基底膜基质添加到消化的类器官中。通过轻轻上下移液混合以避免产生气泡，并立即放在冰上。板300微升类器官圆顶重悬于预热的六孔板中的基底膜基质中。
将板在引擎盖中不受干扰五分钟，然后将其置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下 20 到 30 分钟，以使圆顶凝固。在孵育结束时，向每个孔中加入三毫升预热的完全培养基并将板放回培养箱中。每五到七天加入新鲜的完全培养基。
各种患者来源的乳腺肿瘤类器官系在形态和生长速率上有所不同。C2衍生类器官中的正常乳腺类器官和少数早期导管癌类似于正常的乳房结构，中央腔被导管细胞包围。来源于浸润性小叶癌的类器官倾向于形成松散附着的葡萄串状结构。
同时，源自浸润性导管癌的类器官倾向于形成致密、大而圆形的类器官。在第三天、第六天、第九天和第12天使用发光细胞活力测定法测量类器官的生长，并在接种后的第一天获得基线读数。此处显示了随时间扩展的相同类器官的明场图像。
一些患者来源的类器官系的倍增时间为两天，而有些则需要五天。对建立缓慢的特定类器官系保持耐心很重要。根据我们的经验，增加电镀密度或过滤掉碎屑会促进PDO的生长。
患者来源的类器官（PDO）是药物筛选的优秀模型。它们模拟细胞 - 细胞以及细胞 - 细胞外基质相互作用，这是研究癌症病理生理学的关键。此外，PDO可以进行遗传操作，并可用于在共培养系统中开发异种移植物，使其成为机制研究的绝佳模型。
