我们在这里提出的技术使我们能够通过减少对相邻组织的损伤并提高可重复性来克服手动病变方案的局限性，即使对于没有经验的操作员也是如此。这种技术使我们能够精确地选择诱导病变的位置，而不会损坏周围组织，这要归功于旋转的玻璃毛细管与有针对性的紫外激光相结合。操作 VAST 设备涉及许多步骤，因此我建议您在操作时勾选每个步骤，以确保一切正确完成。
首先使用含有麻醉剂的培养基麻醉幼虫，然后将其转移到每孔含有300微升培养基的96孔板中。打开所有系统组件，包括激光器进行烧蚀。然后，启动自动斑马鱼成像或 VAST 软件，在第一个窗口中选择"板"，然后单击"完成"按钮。
将弹出一个小窗口，询问毛细管是否空且干净。检查毛细管的图像中是否有任何气泡。如果内部没有气泡，请单击弹出窗口中的"是"。
接下来，在 LP 采样器窗口中，转到"文件"菜单，然后选择"打开脚本"选项。选择包含与要执行的实验对应的脚本的文件。然后，在 VAST 软件主窗口中，转到文件并选择打开实验。
选择与计划的实验对应的实验文件。启动 ImageJ/Fiji 软件，转到"文件"菜单，然后选择"新建脚本"以打开脚本窗口。然后，转到"文件"菜单并选择"打开"以加载激光病变脚本。
接下来，要启动 Python IDE，请转到"文件"菜单，然后选择"打开文件"以加载脚本以管理激光器。然后，单击"运行"菜单并选择"运行而不调试"以运行脚本。确保在激光衰减器初始化时，终端面板中出现一系列消息以及一些噪音。
在 VAST 软件的主窗口中，单击箭头按钮以移动载物台，并使毛细管相对于显微镜物镜居中。透过目镜观察，并使用显微镜的透射光聚焦在毛细管的顶部。将含有幼虫的96孔板放在LP采样器的左板支架上。
然后，将另一个板放在采样器的右板支架上进行收集。确保板的A1孔位于支架的左前角。在 VAST 软件的 LP 取样器窗口中，单击板模板按钮，然后选择所有包含幼虫的孔。
单击"确定"按钮以验证并关闭窗口。然后，单击LP采样器窗口中的运行板按钮以开始加载幼虫。接下来，转到显微镜软件，然后单击"实时"按钮对幼虫进行成像。
打开显微镜对焦旋钮，直到脊髓中央管可见。在荧光中拍摄快照并将图像保存到文件夹中。在 ImageJ 中打开图像，并根据需要调整对比度。
单击感兴趣区域线工具，然后绘制一条以脊髓为中心的短线。将显微镜切换到100%反射镜位置。加载 ImageJ 脚本并将重复设置为 2，将"样品"设置为 1，将"宽度"设置为 40 微米，将"衰减"设置为 89。
设置完所有参数后，单击"确定"按钮。激光拍摄序列完成后，在成像软件上切换到荧光成像并调整焦点。拍摄新快照并保存。
在ImageJ中打开这个新图像，并绘制一条比脊髓本身更大的新线。将显微镜切换到100%反射镜位置。转到 ImageJ 脚本窗口，将"重复"设置为 2，将"样本"设置为 1，将"宽度"设置为 40 微米，将"衰减"设置为 89。
设置完所有参数后，单击"确定"按钮。激光拍摄序列完成后，通过成像荧光和聚焦来验证转染质量。确保病变部位没有细胞或轴突保持完整。
转到 VAST 软件主窗口，然后单击"收集"按钮，将病变幼虫收集到空的 96 孔板中。然后，单击复选框托盘指示灯以重新打开 VAST 系统指示灯。尽快从96孔板中取出幼虫，并将它们转移到装有新鲜鱼水的干净培养皿中，以便幼虫在病变后恢复。
将培养皿放入28摄氏度的培养箱中。乙酰化微管蛋白免疫染色和钙成像表明，激光病变完全破坏了脊柱组织的连续性。此图显示了完整的脊髓。
病变尾侧和喙侧之间的轴突完全断裂确认脊髓完全横断。此处显示了不完全横切的示例。本图显示了NBTG cAMP 6-S幼虫上的横断脊髓。
矩形显示用于量化病变的喙侧和尾侧荧光强度的ROI。图形图像表示喙部和尾部分析 ROI 中荧光强度随时间的变化。这里显示了NBT:dsRed幼虫在激光病变前，激光病变3小时，24小时和48小时后的最大强度投影荧光图像。
受伤后24小时后，伤口开始闭合，导致48小时后脊髓初始结构的部分恢复。在损伤后 48 小时后使用钙成像确认部分功能重新连接。尾部区域和喙部区域尖峰振幅之间的比率在损伤后3，24和48小时之间增加。
使用NBT:dsRed mpeg1 GFP幼虫激光病变激光病变后观察到巨噬细胞募集。在手动和激光病变之间的标记细胞数量上没有观察到差异。除非在两种病变条件下，双标记的鱼比病变鱼显示的双标记细胞少。
激光病变比手动病变引起的肌肉和皮肤损伤更少。验证病变是否完全至关重要。病变区域不应看到完整的细胞或结构，只有昏暗的背景。
为了研究脊髓再生，我们使用许多方法，包括免疫组织化学和钙成像。重要的是，我们还可以做电生理学，因为组织可以承受解剖，这与手动病变的动物相反。这项新技术使我们能够通过允许可重复和控制的病变来定量研究损伤后脊髓中的结构和功能组织组织。
