La técnica que proponemos aquí nos permite superar las limitaciones de los protocolos de lesiones manuales al reducir el daño a los tejidos adyacentes y mejorar la reproducibilidad, incluso para operadores sin experiencia. Esta técnica nos permite elegir con precisión dónde inducir la lesión sin dañar los tejidos circundantes gracias al capilar de vidrio giratorio combinado con un láser UV dirigido. Muchos pasos están involucrados en el funcionamiento del equipo VAST, por lo que recomendaría marcar cada paso a medida que avanza para asegurarse de que todo se haga correctamente.
Comience anestesiando las larvas usando el medio que contiene el anestésico, y luego transfiéralas a una placa de 96 pocillos que contenga 300 microlitros de medio por pozo. Encienda todos los componentes del sistema, incluido el láser para la ablación. Luego, inicie la imagen automatizada del pez cebra, o el software VAST, elija Placa en la primera ventana y haga clic en el botón Listo.
Aparecerá una pequeña ventana preguntando si el capilar está vacío y limpio. Verifique la imagen del capilar para detectar burbujas de aire en el interior. Si no hay burbujas de aire en el interior, haga clic en Sí en la ventana emergente.
A continuación, en la ventana LP Sampler, vaya al menú Archivo y seleccione la opción Abrir script. Elija un archivo que contenga el script correspondiente al experimento que se va a realizar. Luego, en la ventana principal del software VAST, vaya a Archivo y elija Abrir experimento.
Elija el archivo de experimento correspondiente al experimento planificado. Inicie el software ImageJ/Fiji, vaya al menú Archivo y elija Nuevo script para abrir la ventana de script. Luego, vaya al menú Archivo y elija Abrir para cargar el script de lesión láser.
A continuación, para iniciar el IDE de Python, vaya al menú Archivo y elija Abrir archivo para cargar el script para administrar el láser. Luego, haga clic en el menú Ejecutar y elija Ejecutar sin depuración para ejecutar el script. Asegúrese de que aparezca una secuencia de mensajes en el panel del terminal junto con algo de ruido mientras se inicializa el atenuador láser.
En la ventana principal del software VAST, haga clic en los botones de flecha para mover el escenario y centrar el capilar en relación con el objetivo del microscopio. Mire a través de los oculares y concéntrese en la parte superior del capilar utilizando la luz transmitida del microscopio. Coloque una placa de 96 pocillos que contenga las larvas en el soporte izquierdo de la placa del muestreador lp.
Luego, coloque otra placa para la recolección en el soporte de placa derecho del muestreador. Asegúrese de que el pozo A1 de la placa esté en la esquina delantera izquierda del soporte. En la ventana LP Sampler del software VAST, haga clic en el botón Plantilla de placa y seleccione todos los pozos que contienen larvas.
Haga clic en el botón Aceptar para validar y cerrar la ventana. Luego, haga clic en el botón Ejecutar placa en la ventana LP Sampler para comenzar a cargar la larva. A continuación, vaya al software del microscopio y haga clic en el botón Live para obtener una imagen de la larva.
Gire la perilla del foco del microscopio hasta que el canal central de la médula espinal esté visible. Tome una instantánea en fluorescencia y guarde la imagen en una carpeta. Abra la imagen en ImageJ y ajuste el contraste si es necesario.
Haga clic en la herramienta de línea de región de interés y dibuje una línea corta centrada en la médula espinal. Cambie el microscopio a la posición de espejo 100% reflectante. Cargue el script ImageJ y establezca Repetición en 2, Muestra en 1, Ancho a 40 micras y Atenuación a 89.
Después de configurar todos los parámetros, haga clic en el botón Aceptar. Cuando finalice la secuencia de disparos con láser, cambie a imágenes de fluorescencia en el software de imágenes y ajuste el enfoque. Tome una nueva instantánea y guárdela.
Abra esta nueva imagen en ImageJ y dibuje una nueva línea más grande que la propia médula espinal. Cambie el microscopio a la posición de espejo 100% reflectante. Vaya a la ventana de script de ImageJ y establezca Repetición en 2, Muestra en 1, Ancho a 40 micras y Atenuación a 89.
Después de configurar todos los parámetros, haga clic en el botón Aceptar. Cuando finalice la secuencia de disparo con láser, verifique la calidad de la transección mediante la obtención de imágenes de fluorescencia y enfoque. Asegúrese de que ninguna célula o axón permanezca intacto en el sitio de la lesión.
Vaya a la ventana principal del software VAST y haga clic en el botón Recolectar para recolectar las larvas lesionadas en la placa vacía de 96 pocillos. Luego, haga clic en la luz de la bandeja de verificación para volver a encender la luz del sistema VAST. Saque la larva de la placa de 96 pocillos lo antes posible y transfiérala a una placa de Petri limpia con agua fresca de pescado para que la larva se recupere después de la lesión.
Coloque la placa de Petri en una incubadora a 28 grados centígrados. La inmunomantación de tubulina acetilada y las imágenes de calcio indican que la lesión láser interrumpe por completo la continuidad del tejido espinal. Una médula espinal intacta se muestra en esta imagen.
Una interrupción completa de los axones entre los lados caudal y rostral de la lesión confirma la transección completa de la médula espinal. Aquí se muestra un ejemplo de transección incompleta. La médula espinal transectada en una larva NBTG cAMP 6-S se muestra en esta imagen.
Los rectángulos muestran los ROI utilizados para cuantificar la intensidad de fluorescencia en los lados rostral y caudal de las lesiones. La imagen gráfica representa el cambio de intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo en el ROIs de análisis rostral y caudal. Aquí se muestran las imágenes de fluorescencia de proyección de máxima intensidad de una larva NBT:dsRed antes de la lesión láser, después de tres horas, 24 horas y 48 horas de la lesión láser.
Después de 24 horas después de la lesión, las heridas comenzaron a cerrarse, lo que llevó a una restauración parcial de la estructura inicial de la médula espinal después de 48 horas. Se confirmó una reconexión funcional parcial después de 48 horas después de la lesión utilizando imágenes de calcio. La relación entre la amplitud de los picos en el área caudal y el área rostral mostró un aumento entre 3, 24 y 48 horas después de la lesión.
El reclutamiento de macrófagos se observó después de lesiones con láser utilizando lesiones láser de larvas NBT:dsRed mpeg1 GFP. No se observaron diferencias en el número de células marcadas entre las lesiones manuales y láser. Los peces no selesionados mostraron menos células de doble etiqueta que los peces lesionados en ambas condiciones de lesión.
La lesión láser induce menos daño muscular y cutáneo que la lesión manual. Es fundamental verificar si la lesión está completa o no. Ninguna célula o estructura intacta debe ser visible en el área de la lesión, solo un fondo oscuro.
Para estudiar la regeneración de la médula espinal, utilizamos muchos métodos, incluyendo inmunohistoquímica e imágenes de calcio. Es importante destacar que también podemos hacer electrofisiología, ya que el tejido puede soportar la disección, al contrario de los animales lesionados manualmente. Esta nueva técnica nos permite estudiar cuantitativamente la organización estructural y funcional del tejido en la médula espinal después de una lesión al permitir lesiones reproducibles y controladas.
