La tecnica che proponiamo qui ci permette di superare i limiti dei protocolli delle lesioni manuali riducendo i danni ai tessuti adiacenti e migliorando la riproducibilità, anche per gli operatori inesperti. Questa tecnica ci permette di scegliere con precisione dove indurre la lesione senza danneggiare i tessuti circostanti grazie al capillare vetro rotante combinato con un laser UV mirato. Molti passaggi sono coinvolti nel funzionamento dell'apparecchiatura VAST, quindi consiglierei di spuntare ogni passaggio mentre si procede per garantire che tutto sia fatto correttamente.
Inizia anestetizzando le larve usando il mezzo contenente l'anestetico, quindi trasferiscile su una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri di mezzo per pozzetto. Accendere tutti i componenti del sistema compreso il laser per l'ablazione. Quindi, avvia l'imaging zebrafish automatizzato o il software VAST, scegli Piastra nella prima finestra e fai clic sul pulsante Fine.
Apparirà una piccola finestra che chiederà se il capillare è vuoto e pulito. Controllare l'immagine del capillare per eventuali bolle d'aria all'interno. Se non ci sono bolle d'aria all'interno, fai clic su Sì nella finestra spuntata.
Quindi, nella finestra LP Sampler, vai al menu File e seleziona l'opzione Apri script. Scegli un file contenente lo script corrispondente all'esperimento da eseguire. Quindi, nella finestra principale del software VAST, vai su File e scegli Apri esperimento.
Scegliere il file dell'esperimento corrispondente all'esperimento pianificato. Avvia il software ImageJ / Fiji, vai al menu File e scegli Nuovo script per aprire la finestra dello script. Quindi, vai al menu File e scegli Apri per caricare lo script della lesione laser.
Successivamente, per avviare l'IDE Python, vai al menu File e scegli Apri file per caricare lo script per gestire il laser. Quindi, fare clic sul menu Esegui e scegliere Esegui senza debug per eseguire lo script. Assicurarsi che venga visualizzata una sequenza di messaggi nel pannello terminale insieme a un po' di rumore durante l'inizializzazione dell'attenuatore laser.
Nella finestra principale del software VAST, fare clic sui pulsanti freccia per spostare il palco e centrare il capillare rispetto all'obiettivo del microscopio. Guarda attraverso gli oculari e concentrati sulla parte superiore del capillare usando la luce trasmessa dal microscopio. Posizionare una piastra a 96 pozzetti contenente le larve sul supporto sinistro del campionatore LP.
Quindi, posizionare un'altra piastra per la raccolta sul supporto destro del campionatore. Assicurarsi che il pozzetto A1 della piastra si trovi nell'angolo anteriore sinistro del supporto. Nella finestra LP Sampler del software VAST, fare clic sul pulsante Modello di piastra e selezionare tutti i pozzetti contenenti larve.
Fare clic sul pulsante OK per convalidare e chiudere la finestra. Quindi, fai clic sul pulsante Esegui piastra nella finestra LP Sampler per iniziare a caricare la larva. Quindi, vai al software del microscopio e fai clic sul pulsante Live per visualizzare la larva.
Accendere la manopola di messa a fuoco del microscopio fino a quando il canale centrale del midollo spinale è visibile. Scatta un'istantanea in fluorescenza e salva l'immagine in una cartella. Aprire l'immagine in ImageJ e regolare il contrasto, se necessario.
Fare clic sullo strumento linea della regione di interesse e disegnare una breve linea centrata sul midollo spinale. Impostare il microscopio in posizione dello specchio riflettente al 100%. Caricare lo script ImageJ e impostare Ripetizione su 2, Campione su 1, Larghezza su 40 micron e Attenuazione su 89.
Dopo aver impostato tutti i parametri, fare clic sul pulsante OK. Al termine della sequenza di riprese laser, passare all'imaging a fluorescenza sul software di imaging e regolare la messa a fuoco. Scatta una nuova istantanea e salvala.
Apri questa nuova immagine in ImageJ e disegna una nuova linea più grande del midollo spinale stesso. Impostare il microscopio in posizione dello specchio riflettente al 100%. Vai alla finestra dello script ImageJ e imposta Ripetizione su 2, Campione su 1, Larghezza su 40 micron e Attenuazione su 89.
Dopo aver impostato tutti i parametri, fare clic sul pulsante OK. Al termine della sequenza di riprese laser, verificare la qualità della trasezione mediante l'imaging della fluorescenza e della messa a fuoco. Assicurarsi che nessuna cellula o assone rimanga intatto nel sito della lesione.
Vai alla finestra principale del software VAST e fai clic sul pulsante Raccogli per raccogliere le larve lesionate nella piastra vuota da 96 pozzetti. Quindi, fare clic sulla spia del vassoio della casella di controllo per riaccendere la luce del sistema VAST. Estrarre la larva dal piatto a 96 pozzetti il prima possibile e trasferirla in una capsula di Petri pulita con acqua di pesce fresco affinché la larva recuperi la post-lesione.
Metti la capsula di Petri in un'incubatrice a 28 gradi Celsius. L'immunocolorazione acetilata della tubulina e l'imaging del calcio indicano che la lesione laser interrompe completamente la continuità del tessuto spinale. Un midollo spinale intatto è mostrato in questa immagine.
Una completa interruzione degli assoni tra i lati caudale e rostrale della lesione conferma la completa trasezione del midollo spinale. Un esempio di transezione incompleta è mostrato qui. Il midollo spinale transettato su una larva NBTG cAMP 6-S è mostrato in questa immagine.
I rettangoli mostrano i ROI utilizzati per quantificare l'intensità di fluorescenza nei lati rostrale e caudale delle lesioni. L'immagine grafica rappresenta la variazione di intensità della fluorescenza nel tempo nei ROI di analisi rostrale e caudale. Le immagini di fluorescenza di proiezione di massima intensità di una larva NBT:dsRed prima della lesione laser, dopo tre ore, 24 ore e 48 ore della lesione laser sono mostrate qui.
Dopo 24 ore dopo l'infortunio, le ferite hanno iniziato a chiudersi, portando a un parziale ripristino della struttura iniziale del midollo spinale dopo 48 ore. Una parziale riconnessione funzionale è stata confermata dopo 48 ore dopo l'infortunio utilizzando l'imaging del calcio. Il rapporto tra l'ampiezza dei picchi nell'area caudale e l'area rostrale ha mostrato un aumento tra 3, 24 e 48 ore dopo l'infortunio.
Il reclutamento dei macrofagi è stato osservato dopo lesioni laser utilizzando lesioni laser larve NBT:dsRed mpeg1 GFP. Non è stata osservata alcuna differenza nel numero di cellule marcate tra lesioni manuali e laser. I pesci non menzionati hanno mostrato meno cellule a doppia etichetta rispetto ai pesci lesionati in entrambe le condizioni di lesione.
La lesione laser induce meno danni muscolari e cutanei rispetto alla lesione manuale. È fondamentale verificare se la lesione è completa o meno. Nessuna cellula o struttura intatta deve essere visibile nell'area della lesione, solo uno sfondo debole.
Per studiare la rigenerazione del midollo spinale, utilizziamo molti metodi, tra cui l'immuno-istochimica e l'imaging del calcio. È importante sottolineare che possiamo anche fare elettrofisiologia, poiché il tessuto può resistere alla dissezione, contrariamente agli animali lesionati manualmente. Questa nuova tecnica ci permette di studiare quantitativamente l'organizzazione strutturale e funzionale dei tessuti nel midollo spinale dopo la lesione consentendo lesioni riproducibili e controllate.
