La technique que nous proposons ici nous permet de surmonter les limites des protocoles de lésions manuelles en réduisant les dommages aux tissus adjacents et en améliorant la reproductibilité, même pour les opérateurs inexpérimentés. Cette technique nous permet de choisir précisément où induire la lésion sans endommager les tissus environnants grâce à un capillaire en verre rotatif combiné à un laser UV ciblé. De nombreuses étapes sont impliquées dans le fonctionnement de l’équipement VAST, je vous recommande donc de cocher chaque étape au fur et à mesure afin de vous assurer que tout est fait correctement.
Commencez par anesthésier les larves à l’aide du milieu contenant l’anesthésique, puis transférez-les sur une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres de milieu par puits. Allumez tous les composants du système, y compris le laser pour l’ablation. Ensuite, lancez l’imagerie automatisée du poisson-zèbre ou le logiciel VAST, choisissez Plate dans la première fenêtre et cliquez sur le bouton Terminé.
Une petite fenêtre apparaîtra demandant si le capillaire est vide et propre. Vérifiez l’image du capillaire pour toute bulle d’air à l’intérieur. S’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur, cliquez sur Oui dans la fenêtre ouverte.
Ensuite, dans la fenêtre LP Sampler, accédez au menu Fichier et sélectionnez l’option Ouvrir le script. Choisissez un fichier contenant le script correspondant à l’expérience à effectuer. Ensuite, dans la fenêtre principale du logiciel VAST, accédez à Fichier et choisissez Ouvrir l’expérience.
Choisissez le fichier d’expérience correspondant à l’expérience planifiée. Lancez le logiciel ImageJ/Fiji, accédez au menu Fichier et choisissez Nouveau script pour ouvrir la fenêtre de script. Ensuite, allez dans le menu Fichier et choisissez Ouvrir pour charger le script de lésion laser.
Ensuite, pour lancer l’IDE Python, allez dans le menu Fichier et choisissez Ouvrir le fichier pour charger le script afin de gérer le laser. Ensuite, cliquez sur le menu Exécuter et choisissez Exécuter sans débogage pour exécuter le script. Assurez-vous qu’une séquence de messages dans le panneau du terminal apparaît avec du bruit pendant l’initialisation de l’atténuateur laser.
Dans la fenêtre principale du logiciel VAST, cliquez sur les boutons fléchés pour déplacer la scène et centrer le capillaire par rapport à l’objectif du microscope. Regardez à travers les oculaires et concentrez-vous sur le dessus du capillaire en utilisant la lumière transmise du microscope. Placez une plaque de 96 puits contenant les larves sur le support de plaque gauche de l’échantillonneur LP.
Ensuite, placez une autre plaque pour la collecte sur le support de plaque droit de l’échantillonneur. Assurez-vous que le puits A1 de la plaque se trouve dans le coin avant gauche du support. Dans la fenêtre LP Sampler du logiciel VAST, cliquez sur le bouton Modèle de plaque et sélectionnez tous les puits contenant des larves.
Cliquez sur le bouton OK pour valider et fermer la fenêtre. Ensuite, cliquez sur le bouton Run plate dans la fenêtre LP Sampler pour commencer à charger la larve. Ensuite, allez dans le logiciel de microscope et cliquez sur le bouton Live pour imager la larve.
Allumez le bouton de mise au point du microscope jusqu’à ce que le canal central de la moelle épinière soit visible. Prenez un instantané en fluorescence et enregistrez l’image dans un dossier. Ouvrez l’image dans ImageJ et ajustez le contraste si nécessaire.
Cliquez sur l’outil de ligne de région d’intérêt et tracez une courte ligne centrée sur la moelle épinière. Basculez le microscope en position miroir réfléchissant à 100 %. Chargez le script ImageJ et définissez Répétition sur 2, Échantillon sur 1, Largeur sur 40 microns et Atténuation sur 89.
Après avoir défini tous les paramètres, cliquez sur le bouton OK. Lorsque la séquence de prise de vue laser est terminée, passez à l’imagerie par fluorescence sur le logiciel d’imagerie et ajustez la mise au point. Prenez un nouvel instantané et enregistrez-le.
Ouvrez cette nouvelle image dans ImageJ et tracez une nouvelle ligne plus grande que la moelle épinière elle-même. Basculez le microscope en position miroir réfléchissant à 100 %. Accédez à la fenêtre de script ImageJ et définissez Répétition sur 2, Échantillon sur 1, Largeur sur 40 microns et Atténuation sur 89.
Après avoir défini tous les paramètres, cliquez sur le bouton OK. Lorsque la séquence de tir laser est terminée, vérifiez la qualité de la transsection en imageant la fluorescence et la mise au point. Assurez-vous qu’aucune cellule ou axone ne reste intact dans le site de la lésion.
Allez dans la fenêtre principale du logiciel VAST et cliquez sur le bouton Collecter pour collecter les larves lésionnées dans la plaque vide de 96 puits. Ensuite, cliquez sur la case à cocher du voyant du plateau pour rallumer le voyant du système VAST. Retirez la larve de la plaque de 96 puits dès que possible et transférez-la dans une boîte de Petri propre avec de l’eau de poisson fraîche pour que la larve puisse récupérer après la lésion.
Mettez la boîte de Petri dans un incubateur à 28 degrés Celsius. L’immunofichitecture à la tubuline acétylée et l’imagerie calcique indiquent que la lésion au laser perturbe entièrement la continuité du tissu rachidien. Une moelle épinière intacte est montrée sur cette image.
Une perturbation complète des axones entre les côtés caudal et rostral de la lésion confirme la transsection complète de la moelle épinière. Un exemple de transsection incomplète est montré ici. La moelle épinière transectée sur une larve NBTG cAMP 6-S est montrée sur cette image.
Les rectangles montrent les ROIs utilisés pour quantifier l’intensité de fluorescence dans les côtés rostral et caudal des lésions. L’image graphique représente le changement d’intensité de fluorescence au fil du temps dans les rois d’analyse rostrale et caudale. Les images de fluorescence de projection d’intensité maximale d’une larve NBT:dsRed avant la lésion laser, après trois heures, 24 heures et 48 heures de la lésion laser sont montrées ici.
Après 24 heures après la blessure, les plaies ont commencé à se refermer, entraînant une restauration partielle de la structure initiale de la moelle épinière après 48 heures. Une reconnexion fonctionnelle partielle a été confirmée après 48 heures après la blessure à l’aide de l’imagerie calcique. Le rapport entre l’amplitude des pointes dans la région caudale et la région rostrale a montré une augmentation entre 3, 24 et 48 heures après la blessure.
Le recrutement de macrophages a été observé après des lésions laser à l’aide de lésions laser de larves de larves mpeg1 MPEG1 NBT:dsRed. Aucune différence n’a été observée dans le nombre de cellules marquées entre les lésions manuelles et laser. Les poissons non sectionnés présentaient moins de cellules à double marquage que les poissons sectionnés dans les deux conditions de lésion.
La lésion au laser induit moins de dommages musculaires et cutanés que la lésion manuelle. Il est essentiel de vérifier si la lésion est complète ou non. Aucune cellule ou structure intacte ne doit être visible dans la zone de la lésion, seulement un fond sombre.
Pour étudier la régénération de la moelle épinière, nous utilisons de nombreuses méthodes, y compris l’immuno-histochimie et l’imagerie calcique. Il est important de noter que nous pouvons également faire de l’électrophysiologie, car le tissu peut résister à la dissection, contrairement aux animaux sectionnés manuellement. Cette nouvelle technique nous permet d’étudier quantitativement l’organisation tissulaire structurelle et fonctionnelle de la moelle épinière après une blessure en permettant des lésions reproductibles et contrôlées.
