تسمح لنا التقنية التي نقترحها هنا بالتغلب على قيود بروتوكولات الآفات اليدوية عن طريق تقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة المجاورة وتحسين قابلية التكرار ، حتى بالنسبة للمشغلين عديمي الخبرة. تسمح لنا هذه التقنية باختيار مكان تحفيز الآفة بدقة دون إتلاف الأنسجة المحيطة بفضل الشعيرات الدموية الزجاجية الدوارة جنبا إلى جنب مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية المستهدف. تشارك العديد من الخطوات في تشغيل معدات VAST ، لذلك أوصي بوضع علامة على كل خطوة أثناء التنقل من أجل ضمان القيام بكل شيء بشكل صحيح.
ابدأ بتخدير اليرقات باستخدام الوسط الذي يحتوي على المخدر ، ثم انقلها إلى صفيحة 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر من الوسط لكل بئر. قم بتشغيل جميع مكونات النظام بما في ذلك الليزر للاستئصال. ثم ، قم بتشغيل التصوير الآلي لأسماك الزرد ، أو برنامج VAST ، واختر Plate في النافذة الأولى ، وانقر فوق الزر تم.
ستظهر نافذة صغيرة تسأل عما إذا كانت الشعيرات الدموية فارغة ونظيفة. تحقق من صورة الشعيرات الدموية بحثا عن أي فقاعات هواء في الداخل. إذا لم تكن هناك فقاعات هواء في الداخل ، فانقر فوق نعم في النافذة المنبثقة.
التالي في نافذة LP Sampler ، انتقل إلى القائمة ملف وحدد خيار فتح البرنامج النصي. اختر ملفا يحتوي على البرنامج النصي المقابل للتجربة المراد تنفيذها. ثم، في نافذة برنامج VAST الرئيسية، انتقل إلى ملف واختر فتح تجربة.
اختر ملف التجربة المقابل للتجربة المخطط لها. قم بتشغيل برنامج ImageJ/Fiji ، وانتقل إلى القائمة ملف ، واختر برنامج نصي جديد لفتح نافذة البرنامج النصي. ثم انتقل إلى القائمة ملف واختر فتح لتحميل البرنامج النصي لآفة الليزر.
بعد ذلك ، لتشغيل Python IDE ، انتقل إلى القائمة ملف واختر فتح ملف لتحميل البرنامج النصي لإدارة الليزر. ثم انقر فوق القائمة تشغيل واختر تشغيل بدون تصحيح الأخطاء لتشغيل البرنامج النصي. تأكد من ظهور سلسلة من الرسائل في اللوحة الطرفية مع بعض الضوضاء أثناء تهيئة مخفف الليزر.
في النافذة الرئيسية لبرنامج VAST ، انقر فوق أزرار الأسهم لتحريك المرحلة وتوسيط الشعيرات الدموية بالنسبة لهدف المجهر. انظر من خلال العدسات وركز على الجزء العلوي من الشعيرات الدموية باستخدام الضوء المنقول من المجهر. ضع صفيحة 96 بئرا تحتوي على اليرقات على حامل اللوحة الأيسر لجهاز أخذ العينات LP.
ثم ضع لوحة أخرى للجمع على حامل اللوحة الأيمن لجهاز أخذ العينات. تأكد من أن بئر A1 من اللوحة في الزاوية اليسرى الأمامية من الحامل. في نافذة LP Sampler لبرنامج VAST ، انقر فوق زر قالب اللوحة وحدد جميع الآبار التي تحتوي على يرقات.
انقر فوق الزر موافق ( OK) للتحقق من صحة النافذة وإغلاقها. ثم ، انقر فوق الزر "تشغيل اللوحة" في نافذة LP Sampler لبدء تحميل اليرقات. بعد ذلك ، انتقل إلى برنامج المجهر وانقر على الزر Live لتصوير اليرقات.
قم بتشغيل مقبض تركيز المجهر حتى تصبح القناة المركزية للحبل الشوكي مرئية. التقط لقطة في التألق واحفظ الصورة في مجلد. افتح الصورة في ImageJ واضبط التباين إذا لزم الأمر.
انقر على أداة خط منطقة الاهتمام وارسم خطا قصيرا يركز على الحبل الشوكي. قم بتبديل المجهر إلى موضع مرآة عاكس بنسبة 100٪. قم بتحميل البرنامج النصي ImageJ واضبط التكرار على 2 والعينة على 1 والعرض على 40 ميكرون والتوهين على 89.
بعد تعيين جميع المعلمات ، انقر فوق الزر موافق ( OK) . عند الانتهاء من تسلسل لقطات الليزر، قم بالتبديل إلى التصوير الفلوري على برنامج التصوير واضبط التركيز. التقط لقطة جديدة واحفظها.
افتح هذه الصورة الجديدة في ImageJ وارسم خطا جديدا أكبر من الحبل الشوكي نفسه. قم بتبديل المجهر إلى موضع مرآة عاكس بنسبة 100٪. انتقل إلى نافذة البرنامج النصي ImageJ واضبط التكرار على 2 والعينة على 1 والعرض على 40 ميكرون والتوهين على 89.
بعد تعيين جميع المعلمات ، انقر فوق الزر موافق ( OK) . عند الانتهاء من تسلسل لقطة الليزر، تحقق من جودة النقل عن طريق التصوير الفلوري والتركيز. تأكد من عدم بقاء أي خلايا أو محاور سليمة في موقع الآفة.
انتقل إلى نافذة برنامج VAST الرئيسية وانقر على زر Collect لجمع اليرقات المصابة في لوحة 96-well الفارغة. ثم انقر فوق ضوء علبة مربع الاختيار للتبديل مرة أخرى على ضوء نظام VAST . أخرج اليرقة من طبق 96 بئرا في أقرب وقت ممكن ، وانقلها إلى طبق بتري نظيف بمياه السمك العذبة حتى تتعافى اليرقة بعد الآفة.
ضع طبق بتري في حاضنة عند 28 درجة مئوية. يشير تلطيخ التوبولين المناعي الأستيل وتصوير الكالسيوم إلى أن آفة الليزر تعطل تماما استمرارية الأنسجة الشوكية. يظهر الحبل الشوكي السليم في هذه الصورة.
يؤكد الاضطراب الكامل للمحاور العصبية بين الجانبين الذيلي والسطحي للآفة الانتقال الكامل للحبل الشوكي. يظهر هنا مثال على التحويل غير المكتمل. يظهر الحبل الشوكي العابر على يرقة NBTG cAMP 6-S في هذه الصورة.
تظهر المستطيلات عائد الاستثمار المستخدم لقياس شدة التألق في الجانبين الذيلية والذيلية للآفات. تمثل الصورة الرسومية تغير كثافة التألق بمرور الوقت في عائد الاستثمار للتحليل السطحي والذيلي. يتم عرض صور التألق القصوى للإسقاط المكثف ليرقة NBT:dsRed قبل آفة الليزر ، بعد ثلاث ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة من آفة الليزر هنا.
بعد 24 ساعة بعد الإصابة ، بدأت الجروح في الإغلاق ، مما أدى إلى استعادة جزئية للبنية الأولية للحبل الشوكي بعد 48 ساعة. تم تأكيد إعادة الاتصال الوظيفي الجزئي بعد 48 ساعة من الإصابة باستخدام تصوير الكالسيوم. أظهرت النسبة بين سعة المسامير في المنطقة الذيلية ومنطقة السطح زيادة بين 3 و 24 و 48 ساعة بعد الإصابة.
لوحظ تجنيد البلاعم بعد آفات الليزر باستخدام آفات ليزر NBT:dsRed mpeg1 GFP. لم يلاحظ أي فرق في عدد الخلايا المصنفة بين الآفات اليدوية والليزر. أظهرت الأسماك غير المتضررة عددا أقل من الخلايا ذات العلامات المزدوجة مقارنة بالأسماك المصابة في كلتا الحالتين الآفتين.
تحفز آفة الليزر تلفا أقل للعضلات والجلد من الآفة اليدوية. من الأهمية بمكان التحقق مما إذا كانت الآفة كاملة أم لا. لا ينبغي أن تكون أي خلية أو بنية سليمة مرئية في منطقة الآفة ، فقط خلفية قاتمة.
لدراسة تجديد الحبل الشوكي ، نستخدم العديد من الطرق ، بما في ذلك الكيمياء النسيجية المناعية وتصوير الكالسيوم. الأهم من ذلك ، يمكننا أيضا القيام بالفيزيولوجيا الكهربية ، حيث يمكن للأنسجة تحمل التشريح ، على عكس الحيوانات المصابة يدويا. تسمح لنا هذه التقنية الجديدة بدراسة كمية لتنظيم الأنسجة الهيكلية والوظيفية في الحبل الشوكي بعد الإصابة من خلال السماح بالآفات القابلة للتكرار والتحكم فيها.
