Методика, которую мы предлагаем здесь, позволяет преодолеть ограничения протоколов ручных поражений за счет уменьшения повреждения соседних тканей и улучшения воспроизводимости даже для неопытных операторов. Эта методика позволяет нам точно выбирать, где индуцировать поражение, не повреждая окружающие ткани благодаря вращающемуся стеклянному капилляру в сочетании с целевым УФ-лазером. В эксплуатации оборудования VAST задействовано много шагов, поэтому я бы рекомендовал отмечать каждый шаг по ходу дела, чтобы убедиться, что все сделано правильно.
Начните с обезболивания личинок с использованием среды, содержащей анестетик, а затем перенесите их на 96-луночную пластину, содержащую 300 микролитров среды на лунку. Включите все компоненты системы, включая лазер для абляции. Затем запустите автоматизированную визуализацию рыбок данио или программное обеспечение VAST, выберите «Тарелка» в первом окне и нажмите кнопку «Готово».
Появится небольшое окошко, спрашивающее, пуст ли капилляр и чист. Проверьте изображение капилляра на наличие пузырьков воздуха внутри. Если внутри нет пузырьков воздуха, нажмите «Да» на появившемся окне.
Затем в окне LP Sampler перейдите в меню Файл и выберите опцию Открыть скрипт. Выберите файл, содержащий сценарий, соответствующий выполняемому эксперименту. Затем в главном окне программного обеспечения VAST перейдите в Файл и выберите Открыть эксперимент.
Выберите файл эксперимента, соответствующий запланированному эксперименту. Запустите программное обеспечение ImageJ/Fiji, перейдите в меню Файл и выберите Новый скрипт, чтобы открыть окно скрипта. Затем перейдите в меню Файл и выберите Открыть, чтобы загрузить сценарий лазерного поражения.
Затем, чтобы запустить среду разработки Python, перейдите в меню Файл и выберите Открыть файл, чтобы загрузить сценарий для управления лазером. Затем щелкните меню Выполнить и выберите «Выполнить без отладки», чтобы запустить сценарий. Убедитесь, что последовательность сообщений на панели терминала отображается вместе с некоторым шумом во время инициализации лазерного аттенюатора.
В главном окне программного обеспечения VAST нажмите на кнопки со стрелками, чтобы переместить сцену и центрировать капилляр относительно объектива микроскопа. Посмотрите через окуляры и сосредоточьтесь на верхней части капилляра, используя проходящий свет микроскопа. Поместите 96-луночную пластину, содержащую личинки, на левый держатель пластины пробоотборника LP.
Затем поместите еще одну пластину для сбора на правый держатель пластины пробоотборника. Убедитесь, что колодец формата А1 пластины находится в переднем левом углу держателя. В окне LP Sampler программного обеспечения VAST нажмите на кнопку шаблона Plate и выберите все скважины, содержащие личинки.
Нажмите кнопку OK, чтобы проверить и закрыть окно. Затем нажмите кнопку Run plate в окне LP Sampler, чтобы начать загрузку личинки. Затем перейдите к программному обеспечению микроскопа и нажмите кнопку Live, чтобы визуализировать личинку.
Включите ручку фокусировки микроскопа до тех пор, пока не будет виден центральный канал спинного мозга. Сделайте снимок во флуоресценции и сохраните изображение в папку. Откройте изображение в ImageJ и при необходимости отрегулируйте контрастность.
Нажмите на инструмент «Линия области интереса» и нарисуйте короткую линию, центрированную на спинном мозге. Переключите микроскоп в 100% отражающее зеркальное положение. Загрузите сценарий ImageJ и установите для параметра «Повторение» значение 2, «Образец» — 1, «Ширина» — 40 микрон и значение «Затухание» — значение 89.
После установки всех параметров нажмите на кнопку OK. Когда последовательность лазерного снимка будет завершена, переключитесь на флуоресцентную визуализацию в программном обеспечении для визуализации и отрегулируйте фокус. Сделайте новый снимок и сохраните его.
Откройте это новое изображение в ImageJ и нарисуйте новую линию больше, чем сам спинной мозг. Переключите микроскоп в 100% отражающее зеркальное положение. Перейдите в окно сценария ImageJ и установите для параметра Повторение значение 2, для параметра Выборка значение 1, для параметра Ширина для 40 микрон и для параметра Затухание значение 89.
После установки всех параметров нажмите на кнопку OK. Когда последовательность лазерного снимка будет завершена, проверьте качество трансекции, визуализируя флуоресценцию и фокусировку. Убедитесь, что никакие клетки или аксоны не остаются нетронутыми в месте поражения.
Перейдите в главное окно программного обеспечения VAST и нажмите на кнопку Collect, чтобы собрать пораженных личинок в пустую 96-луночную пластину. Затем нажмите на индикатор лотка флажка, чтобы снова включить системный индикатор VAST. Выньте личинок из 96-луночной пластины как можно скорее и перенесите их в чистую чашку Петри со свежей рыбной водой, чтобы личинка восстановилась после поражения.
Поместите чашку Петри в инкубатор при температуре 28 градусов по Цельсию. Иммуноокрасление ацетилированного тубулина и кальциевая визуализация указывают на то, что лазерное поражение полностью нарушает непрерывность спинномозговой ткани. Неповрежденный спинной мозг показан на этом изображении.
Полное нарушение работы аксонов между каудальной и ростральной сторонами поражения подтверждает полную трансекцию спинного мозга. Пример неполной трансекции показан здесь. Трансецированный спинной мозг на личинке NBTG cAMP 6-S показан на этом изображении.
Прямоугольники показывают ROI, используемые для количественной оценки интенсивности флуоресценции в ростральной и каудальной сторонах поражения. Графическое изображение представляет изменение интенсивности флуоресценции с течением времени в ROI рострального и каудального анализа. Максимальная интенсивность проекционных флуоресцентных изображений личинки NBT:dsRed до лазерного поражения, через три часа, 24 часа и 48 часов лазерного поражения показаны здесь.
Через 24 часа после травмы раны начали закрываться, что привело к частичному восстановлению первоначальной структуры спинного мозга через 48 часов. Частичное функциональное воссоединение было подтверждено через 48 часов после травмы с использованием кальциевой визуализации. Соотношение между амплитудой шипов в каудальной области и ростральной области показало увеличение между 3, 24 и 48 часами после травмы.
Рекрутирование макрофагов наблюдалось после лазерных поражений с использованием лазерных поражений личинок NBT:dsRed mpeg1 GFP. Не наблюдалось никакой разницы в количестве меченых клеток между ручными и лазерными поражениями. Разве что рыбы показали меньше двойных клеток, чем пораженные рыбы в обоих условиях поражения.
Лазерное поражение вызывает меньше повреждений мышц и кожи, чем ручное поражение. Очень важно проверить, является ли поражение полным или нет. В области поражения не должно быть видно неповрежденной клетки или структуры, только тусклый фон.
Для изучения регенерации спинного мозга мы используем множество методов, включая иммуногистохимию и кальциевую визуализацию. Важно отметить, что мы также можем заниматься электрофизиологией, так как ткань может выдерживать рассечение, в отличие от пораженных вручную животных. Эта новая методика позволяет количественно изучить структурно-функциональную организацию тканей в спинном мозге после травмы, допуская воспроизводимые и контролируемые поражения.
