这种方法的重要性在于，它允许使用相干拉曼成像来量化局部应用的药物产品的可重复性和准确性。其他方法提供笨重的皮肤药代动力学信息，而该方法可以提供体积和微量的皮肤药代动力学信息，例如药物的渗透途径。可视化，定量和渗透途径将允许开发具有特定途径的药物产品以到达目标位点。
组织制备将被证明是这种方法中最具挑战性的部分。组织应该足够薄，以便人们能够通过皮肤阅读。要开始制备裸鼠耳朵皮肤组织，获取安乐死的裸鼠并使用镊子和显微外科剪刀去除小鼠的耳朵。
然后将一只耳朵放在大小为60毫米×15毫米的大型培养皿中。接下来，用PBS冲洗鼠标耳朵两次，每次用任务刮水器将耳朵拍干。如果在24小时内使用，请将耳朵放在PBS中，放入35毫米×10毫米的小培养皿中，温度为2至8摄氏度。
收获24小时后使用，将耳朵放在不含PBS的培养皿中，然后用parafilm覆盖培养皿以零下20摄氏度储存在冰箱中。在生物罩下工作时，将人体皮肤组织放在一个大培养皿中，角质层一侧朝下，以便皮下脂肪可及。然后使用镊子和显微外科剪刀去除皮下脂肪。
一旦皮下脂肪不能再用剪刀去除，使用10刀片一次性手术刀与皮肤成45度角，以去除剩余的皮下脂肪，同时用镊子保持皮肤静止。当脂肪被去除时，将人体皮肤切成一厘米乘一厘米的碎片。对于脂质成像，将小鼠耳朵的前部朝向35毫米零号培养皿的玻璃底部放置。
对于人体皮肤，将角质层朝下放置皮肤，以便从浅层到深层进行药物定量。一旦组织在玻璃底部居中，使用棉尖涂抹器以确保皮肤平坦，并与玻璃底部培养皿的盖玻片表面完全接触。为了防止成像时的任何移动，请将垫圈放在皮肤顶部，并确保通过垫圈的中心孔可以看到组织，以进行刺激拉曼散射或SRS传输检测。
将预先确定剂量的制剂移液到皮肤上，然后用戴手套的手指顺时针摩擦制剂30秒。在分配的配方渗透时间过后，取出多余的配方，然后将皮肤与制剂面朝向玻璃底盘放置。接下来，通过打开显微镜控制或MC软件进行实验设置。
透过目镜观察，使用调节旋钮调整轴向焦点，以确保组织在焦点范围内。完成后，打开泵和斯托克斯光束，并确认ALG1和ALG2通道已启用。确保SRS光电二极管位于聚光镜上方，然后单击MC软件上的Focus x2以可视化CARS和SRS通道中的皮肤。
在“多区域延时摄影”或“MATL”模块中，转到“视图”选项卡，然后单击“注册点列表”以显示成像列表。一旦识别出角质层，滚动轴向焦点或Z焦点以识别特定的组织分层。可以在皮肤内添加特定的深度，例如角质层，皮脂腺，脂肪细胞或皮下脂肪，如在具有脂质调谐对比的实时成像中确定的那样。
但是，如果要采用整个深度堆栈，则可以添加 XY 位置，并且可以忽略相对 Z 位置。如果对每个皮肤分层的特定深度进行成像，请选择“寄存点”以将其添加到 MATL 队列中。对于完整深度堆栈，请单击“采集参数”窗口中的“使用深度选择为每个 XY 位置注册点”。
接下来，在 MATL 模块中将重复次数设置为 1 次，然后单击“就绪”。当“播放”箭头从灰色变为黑色时，按“播放”开始对初步脂质堆栈进行成像。成像周期完成后，阻挡泵浦和斯托克斯光束，并根据目标波数或拉曼振动将激光图形用户界面上的波长更改为所需波长。
调整手动延时阶段，同时确保使用相同的功率对先验建立的脂质和活性药物成分或API进行成像。选择总循环重复次数后，使用光电二极管解锁泵束并检查功率是否与所需功率匹配，然后按“播放”开始对设定点进行自动成像。接下来，通过将皮脂腺脂质图像导入斐济并选中标记为“拆分通道”的框，将文件拆分为CARS和SRS通道，从而对每个皮肤分层进行数据分析。
要打开感兴趣区域或 ROI 管理器，请单击“分析”、“工具”和“ROI 管理器”。使用 SRS 通道使 C 等于 1，对图像中的皮脂腺进行取消选取，并通过单击 ROI 管理器中的添加 T 将标记添加到 ROI 管理器中。对图像中的每个皮脂腺重复该过程。
若要遮盖富含脂质的区域，请选择每个 ROI，然后单击“更多”、“或合并”和“添加选项卡”。要遮盖出脂质较差区域，请使用斐济菜单中的矩形工具，并在整个图像周围绘制一个正方形。将区域添加到 ROI 管理器。
除了在 ROI 管理器中选择所有富含脂质区域的 ROI 之外，还可以单击新添加的方形 ROI。在“更多”下，选择“XOR”以生成脂质贫乏区域的蒙版，并将其添加到 ROI 管理器中。通过按顺序转到“图像”、“堆栈”、“工具”和“连接”选项卡，按数字顺序连接图像。
或者，通过将图像加载到斐济，然后在设置页面上选择一个名为“组具有相似名称的文件”的选项来导入图像。在激活串联图像的同时，转到 ROI 管理器以选择富含脂质的区域，并在选择“多重测量”之前单击“更多”选项卡，然后等待“结果”窗口出现。在结果 窗口中，将数据导出到电子表格，并添加标题为“区域”的列，以将富含脂质的区域添加到每行数据中。
将脂质贫乏添加到脂质以外的区域。若要可视化数据，请将电子表格保存并导入到 R 包 ggplot2 中。然后将数据绘制为图像数量与平均强度的函数，以估计浓度时间数据。
在 RStudio 中对从电子表格导入的强度时间数据运行非区室分析或 NCA，并调用一个图层。完成后，绘制并直观地比较Jmax和AUCflux-all指标。此外，在实验条件下进行统计比较。
代表性分析描绘了角质层，皮脂腺，脂肪细胞，裸鼠耳朵皮肤的皮下脂肪，以及来自人体皮肤的角质层，状真皮和皮脂腺。在裸鼠耳部皮肤中，在配施时和施用后120分钟，以相同的腺体组织深度观察到皮脂腺的有限组织运动。在施用药物120分钟后，皮肤中的大量组织运动显示出几乎看不见的皮脂腺，这表明原始方案的低效率。
在几项研究中，强度与时间曲线显示高初始浓度，随后浓度降低，表明药物没有进一步吸收到组织中。另一方面，一些研究表明强度上升，后来在实验持续时间内下降，表明进入组织的通量在成像之前没有达到最大值。对同一API的两种制剂的浓度时间曲线的NCA分析表明，与凝胶制剂相比，无论皮肤层如何，乙氧基乙氧基乙醇都提供了延长的API渗透性。
相同配方之间的总暴露分析在皮肤的深层显示出类似的观察结果。药物施用后人体皮肤的制备和玻璃底培养皿上的适当皮肤放置对于实验的成功至关重要。这里的明确解决方案表明了这种方法的适用性。
进一步的研究将涉及上市配方，如面霜，以了解配方如何影响API渗透和渗透。
