该协议比较了两种最广泛使用的高光谱相干拉曼散射技术，包括相干反斯托克斯拉曼散射和受激拉曼散射过程，这允许生物学家为其生物学应用选择最佳的成像方式。使用固有的振动特征，相干拉曼光谱能够绘制出化学信息和生物样品，而无需外源性标记。相干拉曼显微镜扩展了我们对细胞代谢、绘图、药物分布、疾病诊断和量化化学变化的理解。
这是一种需要在光学和光谱学方面进行充分培训的技术。我建议在使用这种技术之前阅读一些评论文章并接受专家的培训。首先，通过将一块双面胶带放在盖玻片上来准备成像载玻片，并从胶带中间切出胶带的小矩形形状，为要放置的样品创建一个开放区域。
移液1至2微升纯DMSO，并在空位中心分配液滴。小心地放置顶盖滑轨，轻轻地放置盖玻片的边缘以密封腔室，同时确保DMSO样品不接触胶带的边缘。对于灵敏度实验，在氧化氘中制备DMSO的连续稀释液，得到50至0%的浓度范围，取每种溶液的1至2微升，并制备如前所述压制的样品。
将样品放在显微镜载物台上，如果需要物镜或聚光镜，则加水或浸油。在视野中正确移动DMSO液滴的边缘，调整物镜以获得最佳焦点，然后使用Koler照明方法将聚光镜居中，并完全打开聚光镜上的光圈。接下来，将泵浦光束波长调整为800纳米，以针对2913波数CH3峰值，并通过调整半波片将泵浦和斯托克斯光束的功率设置为显微镜前约30毫瓦。
对于SRS，将锁相放大器增益设置为约10，时间常数为7微秒，确保时间常数小于像素停留时间。使用200×200的像素数设置图像采集参数和采集软件，扫描尺寸约为100×100平方千米，确保图像同时包含DMSO液滴和空白区域，然后扫描样品并在计算机屏幕上检查图像。接下来，扫描斯托克斯泵浦光束中的电动延迟图像，同时监控实时图像并扫描延迟，直到信号最大化。
移动DMSO液滴以覆盖整个视野，并检查直流信号最大值是否在图像中居中，因为信号与泵浦波束相关。通过镜子调整泵浦光束的位置，或在成像软件中调整电压偏移。直流优化后，调整斯托克斯光束反射镜，直到交流信号最大化，方法是调整阈值以显示约50%的饱和度，同时检查饱和度是否在图像中居中。
如果没有，请仅在斯托克斯光束中微调反射镜，并在对准期间监控信号，作为对准质量的实时反馈。对于 SNR 分析，打开 ImageJ 软件并导入保存的 DMSO 示例文本文件，方法是单击“文件”，然后单击“导入”，然后单击下拉菜单中的“文本图像”和“打开”选项。导入图像后，按 Control Shift C 以显示亮度和对比度功能，然后按“亮度和对比度”功能中的“自动”按钮，直到 DMSO 样本的区域显示为饱和，以找到最大样本信号。
接下来，单击 ImageJ 界面上的椭圆形选择工具，并突出显示饱和 DMSO 区域中的一小块区域。高亮显示后，按 M 测量所选区域的均值和标准差。要测量背景，请调整“亮度”和“对比度”功能中的条形，直到可以观察到空白区域的信号，然后单击“椭圆形”选择并突出显示背景的某个区域，确保所选区域不包含DMSO。
然后，按 M 测量所选区域的统计数据。接下来，通过测量噪声平均值和信号平均值以及标准偏差来计算SNR，如前所述。要处理高光谱 CRS 图像，请通过单击下拉菜单中的“文件”，然后单击“导入”、“文本图像”和“打开”选项来导入文本文件。
导入后，单击“图像”，然后单击“堆栈”，然后单击“工具”和“蒙太奇到堆栈”选项，将文件转换为图像堆栈，然后滚动蒙太奇，直到第一个DMSO峰值可见。在 DMSO 上选择一个区域，然后单击“图像”，然后单击“堆栈”和“绘制 Z 轴轮廓”选项，以绘制强度与帧数谱。接下来，单击“列表”并复制配置文件数据以提取原始光谱数据。
要将恢复的频谱转换为频率单位，请使用来自 DMSO 及其相应帧编号的对称和非对称 CH 拉伸执行线性回归。使用高光谱SRS和CARS显微镜测量了DMSO的光谱分辨率，其分辨率分别为14.6和17.1波数，表明SRS具有更好的光谱分辨率。DMSO SRS光谱是在0.1%和0.01%浓度下获得的，其中2913波数处的峰值可以在前者中分辨，但在后者中不能，表明检测限在0.1%至0.01%DMSO之间。
相位检索到的CARS光谱显示，DMSO 2913波数峰可以清楚地解析为0.1%DMSO，但不是表明这两个浓度之间检测限的0.01%。MIA PaCA-2电池的SRS和CARS强度曲线表明，SRS信号的分辨率为398.6纳米，而CARS信号的分辨率为330.3纳米的1.2倍。来自不同光学延迟位置的MIA PaCa-2细胞的SRS和CARS图像显示最强的信号，脂滴作为SRS的亮点，而CARS的对比度大大降低。
然而，光谱聚焦中的37波数红移改善了SRS和CARS的脂质对比度。SRS光谱在2850波数处显示比其他细胞器更强的脂质液滴信号，而CARS光谱显示出小的红移。为了优化相干拉曼散射信号，首先找到样品焦点，然后调整光学延迟，最后微调反射镜，直到达到最大值。
其他泵探头技术（如瞬态吸收）固有地集成到稀而实平台中。该技术对于测量强光吸收非荧光分子的吸收动力学非常强大。该技术允许研究人员以无标记的方式观察具有高化学细胞活性的小分子。
它还允许研究人员查看脂质代谢，细胞内动力学和药物分布的变化。
