Esta metodología es significativa porque permite un método reproducible y preciso para cuantificar los productos farmacéuticos aplicados tópicamente utilizando imágenes Raman coherentes. Otras metodologías proporcionan información farmacocinética cutánea voluminosa, mientras que esta metodología puede proporcionar información farmacocinética cutánea a granel y a microescala, como la ruta de permeación de un medicamento. Las vías de visualización, cuantificación y permeación permitirán el desarrollo de productos farmacéuticos con una vía específica en mente para llegar al sitio objetivo.
La preparación de tejidos demostrará ser la parte más desafiante de esta metodología. El tejido debe ser lo suficientemente delgado para que uno pueda ser capaz de leer a través de la piel. Para comenzar la preparación de un tejido de piel de oreja de ratón desnudo, adquiera ratones desnudos sacrificados y retire las orejas del ratón usando fórceps y tijeras microquirúrgicas.
Luego coloque una oreja en una placa de Petri grande de tamaño 60 milímetros por 15 milímetros. A continuación, enjuague la oreja del ratón con PBS dos veces y seque la oreja cada vez con el limpiaparabrisas. Si se usa dentro de las 24 horas, coloque la oreja en PBS en una placa de Petri pequeña de 35 milímetros por 10 milímetros a dos a ocho grados centígrados.
Para usar después de 24 horas de cosecha, coloque la oreja en una placa de Petri sin PBS, luego cubra la placa con parafilm para almacenar en un congelador a menos 20 grados centígrados. Mientras trabaja bajo la capucha biológica, coloque el tejido de la piel humana en una gran placa de Petri con el lado del estrato córneo hacia abajo para que la grasa subcutánea sea accesible. Luego use fórceps y tijeras microquirúrgicas para eliminar la grasa subcutánea.
Una vez que la grasa subcutánea ya no se pueda eliminar con las tijeras, use un bisturí desechable de 10 cuchillas en un ángulo de 45 grados con respecto a la piel para eliminar la grasa subcutánea restante mientras mantiene la piel quieta con fórceps. Cuando se elimina la grasa, secciona la piel humana en pedazos de un centímetro por un centímetro. Para obtener imágenes de lípidos, coloque la parte anterior de la oreja del ratón mirando hacia el fondo de vidrio de un plato de 35 milímetros con número cero.
Para la piel humana, coloque la piel con el estrato córneo hacia abajo para permitir la cuantificación del fármaco desde las capas superficiales hasta las más profundas. Una vez que el tejido se haya centrado en el fondo de vidrio, use un aplicador de punta de algodón para asegurarse de que la piel esté plana y tenga contacto completo con la superficie deslizante de la cubierta del plato con fondo de vidrio. Para evitar cualquier movimiento durante la toma de imágenes, coloque una lavadora en la parte superior de la piel y asegúrese de que el tejido sea visible a través del orificio central de la lavadora para la detección de dispersión Raman estimulada o detección de transmisión SRS.
Pipetear la dosis predeterminada de la formulación sobre la piel, luego use un dedo enguantado para frotar la formulación en el sentido de las agujas del reloj durante 30 segundos. Después de que haya transcurrido el tiempo asignado para que la formulación penetre, retire el exceso de formulación antes de colocar la piel con el lado de la formulación mirando hacia el plato con fondo de vidrio. A continuación, proceda a la configuración experimental activando el software Microscope Control o MC.
Mirando a través del ocular, ajuste el enfoque axial con la perilla de ajuste para asegurarse de que el tejido esté enfocado. Cuando haya terminado, desbloquee tanto la bomba como los haces stokes y confirme que los canales ALG1 y ALG2 estén habilitados. Asegúrese de que el fotodiodo SRS esté en posición sobre el condensador, luego haga clic en Focus x2 en el software MC para visualizar la piel en los canales CARS y SRS.
En el módulo Multi-Area Time Lapse o MATL, vaya a la pestaña Ver y haga clic en la Lista de puntos registrados para que aparezca la lista de imágenes. Una vez que se identifica el estrato córneo, desplácese a través del foco axial o el foco Z para identificar estratificaciones tisulares específicas. Se pueden agregar profundidades específicas dentro de la piel, como estrato córneo, glándulas sebáceas, adipocitos o grasa subcutánea, según se determine durante las imágenes en vivo con contraste sintonizado con lípidos.
Sin embargo, si se van a tomar pilas de profundidad completas, se pueden agregar posiciones XY y se puede ignorar la posición Z relativa. En el caso de obtener imágenes de profundidad específicas para cada estratificación de la piel, seleccione el punto de registro para agregarlo a la cola MATL. Para pilas de profundidad completas, haga clic en Registrar punto para cada posición XY con selección de profundidad en la ventana Parámetros de adquisición.
A continuación, establezca el número de repeticiones en una en el módulo MATL y haga clic en Listo. Cuando la flecha Reproducir cambie de gris a negro, presione Reproducir para comenzar a obtener imágenes de la pila de lípidos preliminar. Una vez que se haya completado el ciclo de imágenes, bloquee tanto la bomba como los haces de Stokes y cambie la longitud de onda en la interfaz gráfica de usuario del láser a la longitud de onda deseada en función del número de onda objetivo o la vibración Raman.
Ajuste la etapa de retardo de tiempo manual mientras se asegura de que se utilicen los mismos poderes para obtener imágenes de los lípidos y el ingrediente farmacéutico activo o API que se establecen a priori. Una vez que se haya elegido el número total de repeticiones de ciclo, desbloquee el haz de la bomba y verifique si la potencia coincide con la potencia deseada utilizando el fotodiodo antes de presionar Play para comenzar la obtención de imágenes automatizadas de los puntos de ajuste. A continuación, realice un análisis de datos para cada estratificación de la piel importando una imagen lipídica de la glándula sebácea en Fiji y marcando la casilla etiquetada Canales divididos para dividir el archivo en los canales CARS y SRS.
Para abrir el Administrador de región de interés o ROI, haga clic en Analizar, Herramientas y Administrador de ROI. Usando el canal SRS tal que C sea igual a uno, desmarque la glándula sebácea en la imagen y agregue las marcas al Administrador de ROI haciendo clic en Agregar T en el Administrador de ROI. Repita el proceso para cada glándula sebácea dentro de la imagen.
Para enmascarar las regiones ricas en lípidos, seleccione cada ROI y, a continuación, haga clic en más, O Combinar y Agregar pestañas. Para enmascarar las regiones pobres en lípidos, utilice la herramienta Rectángulo en el menú de Fiji y dibuje un cuadrado alrededor de toda la imagen. Agregue la región al Administrador de ROI.
Haga clic en el ROI cuadrado recién agregado, además del ROI que selecciona todas las regiones ricas en lípidos en el Administrador de ROI. En Más, seleccione XOR para generar una máscara de las regiones pobres en lípidos y agréguela al Administrador de ROI. Concatena las imágenes en orden numérico yendo a Imagen, Pilas, Herramientas y concatenar pestañas en orden.
Alternativamente, importe las imágenes cargando una en Fiji y luego seleccionando una opción llamada Agrupar archivos con nombres similares en la página de configuración. Mientras tenga activa la imagen concatenada, vaya al Administrador de ROI para seleccionar las regiones ricas en lípidos y haga clic en la pestaña Más antes de seleccionar Multi Measure, luego espere a que aparezca la ventana Resultados. En la ventana Resultados, exporte los datos a una hoja de cálculo y agregue una columna titulada Región para agregar regiones ricas en lípidos a cada fila de datos.
Agregue lípidos pobres a las regiones que estaban fuera de los lípidos. Para visualizar los datos, guarde e importe la hoja de cálculo en el paquete R, ggplot2. A continuación, trace los datos en función del número de imagen frente a la intensidad media para estimar los datos de tiempo de concentración.
Ejecute análisis no compartimentales o NCA en RStudio en los datos de tiempo de intensidad importados de la hoja de cálculo con la llamada a una capa. Cuando haya terminado, trace y compare visualmente las métricas Jmax y AUCflux-all. Además, realice comparaciones estadísticas entre las condiciones experimentales.
El análisis representativo muestra el estrato córneo, las glándulas sebáceas, los adipocitos, la grasa subcutánea de la piel desnuda de la oreja de ratón y el estrato córneo, la dermis papilar y una glándula sebácea de la piel humana. En la piel desnuda de la oreja de ratón, se observó el movimiento tisular limitado de las glándulas sebáceas con la misma profundidad tisular de las glándulas en el momento de la aplicación de la formulación y 120 minutos después de la aplicación. El movimiento sustancial del tejido en la piel mostró glándulas sebáceas apenas visibles después de 120 minutos de aplicación del medicamento, lo que demuestra la ineficiencia del protocolo original.
En varios estudios, los perfiles de intensidad versus tiempo mostraron altas concentraciones iniciales, seguidas de concentraciones decrecientes, lo que indica que no hay absorción adicional del fármaco en el tejido. Por otro lado, algunos estudios indicaron un aumento en las intensidades que luego disminuyeron durante la duración experimental, demostrando que el flujo en el tejido no había alcanzado un máximo antes de la obtención de imágenes. El análisis de la NCA de los perfiles de tiempo de concentración de dos formulaciones para el mismo API indicó que el etoxi-etoxietanol proporcionó una permeación API extendida en comparación con la de la formulación del gel, independientemente de la capa de la piel.
El análisis de exposición total entre las mismas formulaciones mostró observaciones similares en las capas más profundas de la piel. La preparación de la piel humana y la colocación adecuada de la piel en el plato con fondo de vidrio después de la aplicación del medicamento son fundamentales para el éxito del experimento. Las soluciones claras aquí demostraron la idoneidad de esta metodología.
La investigación adicional incluirá formulaciones comercializadas como cremas para comprender cómo la formulación afecta la penetración y permeación de API.
