该协议允许我们分离和培养高双BBT，只有小鼠心肌细胞知道。为了评估线粒体功能，可以通过实际的银通量分析仪分析心肌细胞的耗氧率。该技术的优点之一是，心肌细胞的耗氧量可以轻松地以 96-well 格式以粘附状态测量，从而能够测试具有大量复制的多种条件。
该容器为心脏病学研究领域提供了重要的见解。除了耗氧，我们还可以研究其他代谢参数，如灰度和呼吸性环氧。实现心肌细胞的高变异性对于这个实验至关重要。
这需要有效的心脏消化。由于新生儿心肌细胞非常脆弱，温柔处理心肌细胞也很重要。在细胞培养罩中，将5ml的HBSS分到6井细胞培养板的每个井中，并放在冰上。
此外，将10ml的HPSS加入10cm细胞培养皿，然后在50ml无菌锥形管中准备20ml的尝试素消化液。将所有溶液放在冰上。接下来，提取心脏并立即转移到含有HBVS的无菌细胞培养皿。
去除任何残留的肺组织和较大的血管。用柔和的搅拌洗心。随后，用细剪刀将心脏切成8块，用钳子将心脏组织转移到HPSS的6井细胞培养板的一个井中。
使用 Moria 勺，在充满 HBSS 的 6 井板中，将其从井转移到井中，清洗心脏组织。然后将心脏组织转移到含有20ml Trypsin的锥形管中，并在4摄氏度的温和搅拌下孵育4小时。在这个过程中，在37摄氏度的水浴中预热胶原酶消化溶液。
将含有心脏组织和消化不良溶液的锥形管从4摄氏度转移到细胞培养罩。让心脏组织沉入管底，使用10ml血清移液器去除消化不良溶液。接下来，在管中加入10mlHS。
用HPSS重新吸收心脏组织2至3次，使用10ml血清移液器洗净尝试素。吸气HSS和添加10毫升预预热胶酶消化溶液到管与心脏组织。对于第一次消化，在37摄氏度的水浴中用心脏组织孵育管，10分钟不搅拌。
之后，将管子转移到细胞培养罩。使用 10ml 血清移液器轻轻重新吸收组织 10 次，使组织重新缝合。这将允许心脏分散，细胞从心脏组织释放。
让未消化的组织下沉。将富含心肌细胞的消化溶液转移到新的锥形管中，并立即添加同等数量的细胞培养基，以阻止胶原酶消化。然后加入10ml的胶原酶消化液到管中含有剩余的未消化的心脏组织。
对于第二次消化，在37摄氏度的水浴中用心脏组织孵育管，10分钟。重复第一次消化的过程，在停止胶原酶消化之前，将心肌细胞中丰富的消化溶液转移到新的锥形管中。接下来，将无菌细胞过滤器放在新的无菌 50ml 锥形管中。
用2至3ml细胞培养器预湿细胞过滤器，并通过细胞过滤器传递细胞。随后，用细胞培养培养剂冲洗细胞过滤器。然后，在180倍重力下，将含有心肌细胞的锥形管离心5分钟。
5分钟后，吸进上经剂，在10ml细胞培养培养中重新暂停细胞颗粒。将细胞板到10cm细胞培养盘上，孵育一小时。之后，轻轻搅动盘子。
用10ml血清移液器在培养皿上反复移液细胞培养培养，洗掉非粘附细胞，重新暂停细胞。然后，将非粘附细胞转移到一个新的10cm细胞培养皿中，再孵育一小时。一小时后，轻轻搅拌盘子，洗掉非粘附细胞。
将心肌细胞转移到新的50ml锥形管中。接下来，在96井细胞培养板的每个井中，通过等50微升的涂层溶液来准备一个96井培养板。如果存在气泡，请使用 20 微升移液器将其清除。
在 37 摄氏度下孵育板至少一小时，以便干燥基质涂层。然后，使用血细胞计计算细胞。将细胞板板到外细胞基质涂层96井细胞培养板，密度为每井1万至3万个细胞。
将细胞放在细胞中。要预制耗氧测定，请水合通量分析仪传感器盒至少 3 小时，在公用板的每个井中加入 200 微升的校准液。将传感器盒放回实用板，在 37 摄氏度内孵育，无需 CO2 或 O2 补充至少 3 小时。
在测定前一小时，轻轻取出细胞培养基，用200微升预预警线粒体应激测试培养基洗涤细胞两次。第二次洗涤后，加入175微升预预警线粒体应激测试介质。然后在37摄氏度下培养细胞，无需二氧化碳或补充氧气。
在线粒体压力测试介质中准备3ml的每个测试化合物。使用多通道移液器将每个化合物的 25 微升加载到传感器盒的喷油器端口中。细胞的状态和任何预处理可能影响注射未组联器FCCP导致的最大恢复。
细胞对非反应器的敏感性也会改变，因此，优化每个特定治疗的FCCP工作浓度至关重要。随后，建立细胞外通量测定协议并启动程序。首先，将传感器卡蒂里奇放入机器进行校准。
校准步骤完成后，更换检测板的校准器。如果需要，在检测后，使用多通道移液器小心丢弃所有检测介质。并且储存细胞培养球蛋白在负20摄氏度，以利用蛋白质测定进行未来的细胞正常化。
通过使用所述的规程，心脏从第0天新生儿幼崽分离，心肌细胞在96孔板中每孔10、20或3万个细胞的密度下播种。经过一夜培养，心肌细胞被发现很好地附着在涂层的塑料表面，并且很少有未连接的细胞。在这一点上，自发收缩心肌细胞很容易看到。
每井3万个细胞的种子密度在种子细胞扩散一天后出现汇合。心肌细胞在免疫上被免疫，并含有针对心肌细胞特异性标记物沙康α行为素的抗体。如这里所示，大多数细胞显示α作用素的正染色，表明心肌细胞分离的高纯度。
此处显示了一个典型的线粒体应激测试方案。线粒体压力测试从氧气消耗率的基准线测量开始，随后注射抑制 ATPA 的 Oligo myosin。然后，注射未联合剂FCCP，以测量最大耗氧率。
最后，随着两个电子传输复合抑制剂的注射，线粒体呼吸完全停止，OCR降至最低水平。获得一致且可重现的结果。实现高生存率至关重要。
因此，重要的是使用新生儿和轻轻处理心肌细胞的心脏组织。通过使用新的或现有的基因操纵的小鼠线，这种方法可以很容易地转化为数据，可能导致了解新的机制的生物能量调节在心脏。线粒体在心脏功能中起着关键的作用。
我们期望这种方法有助于识别新的调节剂和调节氧化代谢的通路，并找到治疗心力衰竭的新治疗靶点。
