该协议强调了肿瘤微环境在激活癌症相关成纤维细胞或CAF方面的重要性。研究表型特征的体外模型可能是极好的。CAF生物学的主要限制在于原发性肿瘤活检样本中CAF的可用性有限。
因此，这种技术可用于研究CAF生物学的各个方面。这项研究描述了与CAF激活相关的异常交叉生产和线粒体功能障碍，导致肿瘤预后不良。该方法的应用将有助于评估肿瘤的创伤相互作用，特别是CAF活化和线粒体健康。
以探索新型药物靶点。在执行此技术之前，个人必须具有细胞程序的经验。该技术的视觉演示将允许了解将CAF群体与肿瘤球体分离的关键步骤以及研究CAF生物学的下游应用。
Leena Arora小姐，Moyna Kalia小姐和Soumyajit Roy夫人，我实验室的助手进行实验。为了开始在DMEM中生长人肺腺癌A549和人肺成纤维细胞MRC-5贴壁细胞，在RPMI中生长人单核细胞THP-1细胞在37摄氏度的T25烧瓶中在含有5%二氧化碳的加湿室中完全生长培养基。
三天后，在80%至85%的细胞汇合度下，用一毫升PBS洗涤A549和MRC-5细胞一分钟。接下来，通过将细胞与500微升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液在37摄氏度下孵育5分钟来收获细胞。然后，立即加入四毫升完全生长培养基以灭活胰蛋白酶。
将细胞悬液收集到15毫升管中，并以125×g沉淀五分钟。除去上清液并将细胞重悬于5毫升完全生长培养基中。为了建立多细胞肿瘤球状体，使用一毫升体积的细胞计数器计数 A549、MRC-5 和 THP-1 细胞数。
计数后，以5:4:1的比例制备细胞悬液，并用完整的DMEM将体积补足至一毫升。接下来，将一滴25微升细胞悬浮混合物滴在90毫米培养皿的盖子上。用 10 毫升无菌水填充盘子底部。
小心地将盖子倒置在充满水的水合室上，并将培养皿放入细胞培养箱中三天。第四天，在显微镜下监测球体。要获取图像，请打开电源开关。
将90毫米培养皿放在载物台上，然后选择10倍放大倍率。调整镜片并检查细胞以分析细胞聚集和增殖。按提供的冻结和保存按钮以捕获图像。
成像后，用新鲜培养基小心地从每个液滴中吸出20微升培养基来更换生长培养基。对于活死映像，打开 Ctr 高级，即开关一，然后打开 CPU，等待软件系统启动。启动后，将含有球体的90毫米培养皿放在倒置荧光显微镜的载物台上。
然后，通过选择软件中的荧光选项并选择钙黄绿素和德克萨斯红通道的FITC来观察和捕获10倍放大倍率的图像。接下来，选择选项，实时并查看图像。调整荧光强度以进行适当的优化，然后单击安全按钮。
在第7天和第10天使用1毫升移液管和15毫升管收集200个肿瘤，每个球状体。然后通过以125×g离心5分钟来沉淀球状体，并小心地吸出上清液。用200微升PBS洗涤球体，再次离心并弃去上清液。
加入400微升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液用于球状体崩解，并在37摄氏度下孵育10分钟。进行剧烈移液以使球体完全崩解。通过加入一毫升完整的DMEM生长培养基来中和胰蛋白酶。
然后离心球状悬浮液并弃去上清液，然后将沉淀重悬于一毫升完整的DMEM培养基中。如图所示计算单元格总数。为了从肿瘤球体中分离癌症相关成纤维细胞或CAF，在80微升冷磁活化细胞分选或MACS缓冲液中将1 x 10重悬至第七个细胞。
将20微升抗成纤维细胞微珠加入细胞悬液中，轻轻敲击试管并在室温下孵育30分钟，充分混合。孵育后，用一毫升冷MACS缓冲液洗涤细胞。然后离心并吸出上清液，然后将沉淀重悬于500微升MACS缓冲液中。
对于基于磁珠的细胞分离，通过用三毫升MACS缓冲液冲洗MACS柱来制备MACS色谱柱。将细胞悬液放入色谱柱中，并收集含有未标记细胞群的流经。接下来，用三毫升MACS缓冲液清洗色谱柱三次，然后将其从分离器中取出。
然后将色谱柱放在收集管上。通过加入五毫升MACS缓冲液并将柱塞牢固地推入柱中来收集抗成纤维细胞微珠标记的细胞。离心标记的细胞，然后再进行下游应用。
计数分离的CAF的数量，并使用大约6 x 10至第四个细胞进行流式细胞术分析。用PBS洗涤细胞一次，然后离心并吸出上清液。接下来，加入100微升细胞透化缓冲液，并将细胞在4摄氏度下孵育30分钟，间歇涡旋以维持单细胞悬液。
同样，在透化缓冲液中离心并重悬细胞后，加入两微升APC偶联的抗人α SMA抗体，并在4摄氏度下孵育45分钟。孵育后，加入一毫升透化缓冲液并离心以除去多余的抗体。将沉淀重悬于400微升透化缓冲液中，用于流式细胞术。
在根据细胞的前向和侧向散射区分细胞群后选择 ACTA2 阳性细胞。选择单重态群体，然后选择在单参数直方图上显示为单个峰的ACTA2阳性细胞。这里显示了多细胞肿瘤球状体的发展和活死体分析。
在第七天，球体紧凑而坚硬，直径约为260微米。在第10天，球体的直径为480微米。在细胞活力测定中，观察到碘化丙啶荧光降低，钙黄绿素-AM荧光从第7天到第10天增加。
缺氧染色显示第10天球状体中心的缺氧核心。此外，观察到E-钙粘蛋白和Mki-67基因表达随着肿瘤球状体形成天数的增加而上调。从第10天肿瘤球体分离的CAF约为69%ACTA2阳性。
与MRC-5成纤维细胞相比，CAF在ACTA2中显示出3倍的上调，在1型α 2链中显示出10倍的上调。与第7天相比，观察到第10天肿瘤球状体的ROS水平显着增加，表明ROS生成可能参与CAF激活。从第7天和第10天肿瘤球体中分离的CAF中观察到细胞ROS水平显着增加。
此外，通过JC-1染色观察到线粒体膜电位的改变。与正常成纤维细胞相比，在CAF中观察到GLUT1和MCT4基因表达的诱导。与正常成纤维细胞相比，在CAF中观察到乳酸脱氢酶，细胞色素C氧化酶和琥珀酸脱氢酶活性的显着诱导。
A549、MRC-5 和 THP-1 细胞的比例必须为 5:4:1 才能成功开发 3D 多细胞肿瘤球状体。成纤维细胞群对肿瘤球状体的刚性至关重要。与阳离子溶液和表征类似，也可以使用该肿瘤球体来获得肿瘤相关的巨噬细胞群，这是肿瘤进展的帮凶。
这种球状体分析将帮助我们了解癌细胞如何参与CAFs激活，也可用于检查线粒体特异性候选药物。
