以下视频的总体目标是演示使用合并的shRNA表观遗传文库进行阴性选择筛选。该筛选能够通过测序鉴定特定的表观遗传靶标。该程序可以帮助确定负责介导AML中获得性阿糖胞苷耐药性的表观遗传因素步骤如下。
选择最有效的启动子以获得shRNA的持久和长期表达。目前的方案侧重于在阿糖胞苷耐药MV4-11细胞系中使用表观遗传因子shRNA文库进行RNAi筛选。用于此目的的启动子是人EF-1 α，人CMV和SFFV，它们表达绿色荧光蛋白的启动子。
使用台盼蓝排除法进行细胞计数。将细胞悬浮在含有每mL聚苯乙烯8微克的10%RPMI培养基中。将100万个细胞接种在六孔板的每孔1.5ml培养基中，一式三份。
加入不同体积的浓缩慢病毒。例如，慢病毒，例如10，20和40微升，取决于慢病毒对每个孔的滴度。轻轻旋转盘子以混合内容物。
通过在37摄氏度下以920g离心90分钟进行旋转干燥。立即在二氧化碳培养箱中孵育板。在48小时结束时观察GFP，并在72小时结束时量化GFP。
接下来，按照流程图中描述的步骤选择在整个培养物中表现出一致的GFP表达的启动子。制备合并的慢病毒人表观遗传因子shRNA文库。在三个10厘米的细胞培养皿中以低传代数培养293T细胞，具有良好的增殖率，每个板中含有8ml 10%DMFM培养基。
一旦细胞达到60%汇合度，请完全用新鲜培养基替换。按照概述制备转染混合物，其中包含无血清培养基，慢病毒包装质粒PAX2，包膜质粒pMD2。G、合并文库质粒，最后转染试剂。
点击混合物充分混合，并在室温下孵育15分钟。将转染混合物加入293T细胞中，并通过旋转板轻轻混合。在二氧化碳培养箱中孵育板。
24 小时后更换培养基。48小时后，在荧光显微镜下检查GFP表达，以确保高转染效率进入293T细胞。收集病毒48，60和72小时后收集病毒上清液，并在收集病毒后的每个时间点加入新鲜培养基8ml。
用0.4微米过滤器过滤合并的病毒。为了获得高滴度的病毒，通过超速离心浓缩合并的病毒。将过滤的病毒上清液转移到70 Ti管中，并在18， 000g下离心2小时。
使用预冷转子和4度离心机。小心地从离心机中取出管子并完全除去上清液。使用微量移液管将沉淀轻轻地重悬于400微升DMEM中，不含FBS和抗生素，在冰上孵育1小时。
等分病毒，并在零下80度冷冻。如图所示计算病毒的浓度。慢病毒转导效率的估计。
用不同体积（2、4和8）的浓缩病毒转导293T细胞，以确认慢病毒的成功制备。将浓缩病毒的值提高到100X以在靶细胞系中进行滴定实验。将100万靶细胞系在1.5ml含有每ml8微克聚苯乙烯的10%RPMI培养基中，在一孔六孔板中。
添加四个不同的体积，1，1.5，2，2.5微升的100X病毒。通过在37摄氏度下将板在920g下离心90分钟进行旋转干燥。72小时后，通过流式细胞术测量GFP阳性细胞的百分比。
确定病毒的体积，以获得30%的转导效率。这种低转导效率是为了确保每个细胞的单个shRNA整合。耐药细胞系中合并的表观遗传shRNA文库的转导。
根据病毒整合物的数量计算实验的细胞数量，如下所示。将1100万个细胞重悬于16 ML的10%RPMI培养基中。加入聚丁二烯，每毫升8微克，搅拌均匀，然后加入所需体积的病毒，得到前计算的30%转导效率。
将所有细胞以每孔1.5ml每孔100万个细胞的密度接种在六孔板上。将板在37摄氏度下以920g离心90分钟。将板在二氧化碳培养箱中孵育过夜。
24小时后，更换培养基并将转导细胞转移到T-75烧瓶中。48小时后，在荧光显微镜下检查GFP以确保转导成功。72小时后，通过流式细胞术定量GFP。
富集GFP阳性细胞。通过将转导细胞以每毫升50万的密度培养5至7天来扩增转导细胞，并在流动分选设置为高纯度和低产量的情况下进行流动分选。在10%RPMI培养基中培养分选的细胞。
72小时后，对GFP阳性细胞的百分比进行分选后估计，保证95%以上的分选效率。辍学筛查，以确定介导耐药性的表观遗传因素。在10%RPMI中培养shRNA文库转导的细胞长达5天。
一式两份离心1000万个细胞。弃去上清液并将沉淀储存在零下80度。这些样品将作为表观遗传shRNA文库的基线参考。
将剩余的转导细胞培养为重复的R1和R2，每个都保持在细胞计数，提供库的500X表示。用药物治疗其中一种重复物，10微摩尔阿糖胞苷，另一种不使用药物治疗。每72小时更换一次有药瓶和不带药物的培养基。
重复更换培养基三次，累积药物暴露9天。药物治疗第9天后，用台盼蓝排除法检查细胞的活力。旋转剩余的活细胞，用无菌PBS洗涤，并在室温下以280g离心5分钟。
弃去上清液并将沉淀储存在零下80度以进行DNA提取。通过PCR扩增整合的shRNA。从转导的基线细胞，处理和未处理的细胞中提取DNA，然后使用荧光计检查浓度，计算所需的DNA量，如图所示，并对样品进行第一轮PCR。
PCR反应混合物在表2中描述了具有热循环仪的条件。建立每个管含有850纳克DNA的多个反应，总共43个反应。合并PCR产物并纯化它们。
在50微升缓冲液中洗脱产品并对其进行定量，最后以零下20微升的速度储存。对于第二轮PCR，使用反向索引引物，试剂在表4中制成表格。每个样品的总反应体积为50微升，用500纳克的初级PCR产物建立四个反应以及阴性对照。
使用2%TBE琼脂糖凝胶加载整个产品进行电泳，并用一个KB分子分子量标准品确认条带尺寸。在凝胶文档系统上可视化PCR产物。切除特定条带并使用凝胶纯化试剂盒纯化。
使用该试剂盒进行纯化的计算结果见表3。在最终体积为30微升的洗脱缓冲液中洗脱，每种洗脱液的近似浓度约为每微升80至90纳克。下一代测序和数据分析。
凝胶纯化产物进行下一代测序，以获得耗尽的shRNA需求的读取计数。修剪适配器序列，将过滤后的读取与参考序列对齐，使用 SAMtools 加载文件以获取对齐摘要。在CRISPRCloud2中加载修剪的fastQ文件，并按照说明执行分析。
点击为CRISPRCloud2提供的链接。选择屏幕类型作为生存和辍学屏幕。设置组的数量并键入每个组的名称。
将参考库作为 FASTA 文件格式上传。上传的数据将被处理，结果在给定的URL中可用。代表性数据。
该图显示了用增加阿糖胞苷浓度，0.1微摩尔至1，000微摩尔以及通过MTT测定进行活力评估的MV4-11亲本和耐药细胞。该图显示了在 72 小时结束时通过流式细胞术定量的 GFP 的代表性流图，用于人 EF-1 α、人 CMV 和 SFFV 启动子。人CMV显示我们的异质峰，而人EF-1α和SFFV显示单个均质峰。
该图显示了MV4-11中三种不同启动子效率的条形图。SFFV驱动的GFP在长期培养中显示出GFP的沉默。hEF-1 α驱动的GFP细胞在分选后显示出这些细胞的持续表达。
左图显示了在荧光显微镜下48小时结束时在293T中转染的混合shRNA文库的转染效率。右图显示了池病毒在具有不同病毒体积（2、4和8微升）的293T细胞中的转导效率。该图代表了MV4-11耐药细胞系中不同体积病毒的转导效率，如1，1.5，2，2.5微升，以实现30%的转导效率。
该图显示了GFP阳性细胞的分选，转导效率为30%，具有高纯度和低产率分选设置。该图显示了GFP阳性分选细胞在长期暴露于阿糖胞苷9天的药物治疗示意图，然后检查活力并收集细胞以获取DNA。该图显示了第一轮和第二轮PCR中使用的引物的结合区域。
该图说明了第一轮PCR末端的PCR产物，397碱基对和第二轮PCR产物399碱基对的条带大小，该产物被凝胶洗脱，纯化并给予NGS。该图说明了富集或耗尽的shRNA的表示，这些shRNA靶向可能介导AML中阿糖胞苷耐药性的表观遗传因子。结论。该协议强调了靶向敲低筛选的重要性，以系统地询问必需和非必需基因，并证明将这种方法用作功能平台，允许识别负责耐药性的靶标。
