我们的方案使用从不同气候区域获得的土壤样本研究土壤中的酵母和霉菌多样性。这提供了对环境酵母多样性的见解，并有助于跟踪致病物种。该协议提供了一种从土壤中收获酵母和霉菌的具有成本效益且快速的方法。
土壤样品可以完全处理，在短短七天内获得分离物。组织良好的实验设置，例如标记培养管和提前一天准备培养基是避免在实验过程中感到不知所措的关键。从准备一组无菌13毫升培养管开始。
通过用土壤样品ID标记它们，然后使用血清学移液管在每个管中加入五毫升酵母提取物 - 肽酮 - 葡萄糖汤，其中补充了氯霉素和苯菌灵。在二级生物的生物安全柜内，使用无菌的木制平面尖端施用器将大约0.1克的土壤转移到适当的培养管中。将管子牢固地盖在第一个停止点，防止溢出，同时允许在孵育过程中进行空气交换。
接下来，将培养管在滚筒中孵育24小时，温度被认为是最大化酵母生长的最佳温度。然后在将上清液转移到固体培养基之前，用土壤样品ID标记氯霉素和苯甲酰辅酵母提取物蛋白胨 - 葡萄糖琼脂平板。从滚筒上取下培养管。
然后在二级生物的生物安全柜内，短暂地涡旋管子，将可能沉降在底部的土壤颗粒和细胞拉回悬浮液。接下来，使用微量移液将100微升上清液转移到平板上。使用无菌可重复使用的细胞扩散器将液体彻底均匀地涂抹在琼脂表面上。
在允许足够的两到三天的孵育时间后，检查生物安全柜内是否存在二级生物体的酵母生长的板。寻找乳状，圆形，哑光状酵母，可以很容易地与细菌和霉菌菌落区分开来。使用无菌木制普通尖端涂抹器棒从每个盘子中选择一个酵母样菌落。
将每个选定的菌落转移到新鲜酵母提取物蛋白胨 - 葡萄糖琼脂平板上，其中补充了氯霉素和苯甲酰以及单个菌落的条纹。执行三个单独的条纹，并对每个条纹使用新的涂抹棒。接下来，使用在平板上发育的新鲜细胞进行集落聚合酶链反应。
使用内部转录的垫片 ITS1 和 ITS4 引物扩增真菌条编码基因。比较获得的酵母菌株的内部转录间隔序列，将两个序列沉积在公共数据库中，例如国家生物技术信息中心GenBank和UNITE以确定物种身份。将土壤加入含有一毫升Sabood葡萄糖汤的1.5毫升微量离心管中，并在50摄氏度下孵育两到四天。
为了将菌丝体从土壤接种的肉汤转移到麦芽提取物琼脂平板上，首先，识别具有可见菌丝生长的土壤接种物，将Saboorod葡萄糖肉汤添加到空气边界。然后使用灭菌的木制平头涂抹器棒将菌丝体转移到麦芽提取物琼脂平板的中心，并将这些麦芽提取物琼脂平板设定为37摄氏度孵育三天。对于具有烟曲霉形态特性的菌丝体的选择，确定具有特征性绿色摇摆样生长的霉菌菌落。
在二级生物的生物安全柜内，通过使用灭菌的木制平面尖端涂抹器棒或接种环刮擦表面一次来收获分生孢子或菌丝体，并通过在琼脂上划线将其转移到麦芽提取物琼脂板的中心以进行单个菌落。将板在37摄氏度下孵育两天。使用无菌应用棒或接种环，通过将菌落划线一次，将产生的单个菌落传代到麦芽提取物琼脂上。
将收获的孢子铺开到板的中心。准备无菌的30%甘油溶液以收获烟曲霉孢子或菌丝体用于培养储存。琼脂平板在37摄氏度下孵育两天后，使用移液管吸出一毫升30%甘油溶液并将其分散到烟曲霉菌落上。
对于烟曲霉菌株的表型鉴定，吸取10微升菌丝和孢子储量以加入990微升水。涡旋这种稀释的孢子悬浮液，并将10微升的悬浮液分配到标准显微镜载玻片上。然后使用400X放大倍率的复合显微镜观察悬浮液并定位分生孢子。
将观察到的分生孢子团形态与烟曲霉菌分生孢子体形态进行比较。要确定九个微卫星位点中每个位点的正确片段大小，请使用能够进行片段分析的软件。检索从毛细管电泳中获得的原始数据，并使用碎片分析软件根据最大峰对片段大小进行评分。
接下来，将片段大小转换为九个低值中每个的重复数，使用参考菌株Af293的重复数的片段大小。从从9个国家的53个地点收集的3，826个土壤样本中，分离出1， 473个酵母菌株。每个国家的最佳孵化温度是根据其年平均温度确定的。
在每个国家的稀疏程度分析中，香农多样性指数被用作土壤酵母多样性的衡量标准。由此产生的稀疏度曲线接近饱和渐近线，表明额外的采样不太可能产生更多的酵母多样性。平板上的菌丝生长形成了烟曲霉菌典型的绿色摇摆形态。
其他耐热真菌物种可能存在于同一土壤样品中，并在同一板上或单独生长烟曲霉。用光学显微镜观察和鉴定的烟曲霉菌分生孢子团结构表明，分生孢子在棒状物上有一个球，分生孢子是单晶状的，其中附着在分生孢子链上的鞘膜直接附着在球形囊泡上。生成的双绦氨酸色谱图揭示了三个通道，可视化了烟曲霉菌二核苷酸，三核苷酸和四核苷酸短串联重复位点的片段长度。
可以使用 R 脚本生成高质量的最小跨度网络 plot_poppr_msn 或 imsn。对主要成分的歧视性分析是可视化菌株之间遗传关系的另一种方法。在生长培养基中添加苯菌灵和氯霉素分别可防止霉菌和细菌生长，有利于酵母菌的选择。
氯霉素还可以减少培养基中的发酵，降低孵育管中的气体积聚。对土壤样本进行宏基因组学将提供有关文化多样性的更多信息。对烟曲霉菌菌株的敏感性检测将识别耐药基因型的存在。
该方案可以应用于其他酵母和霉菌系统，几乎不需要修改。它促进了全球范围内对培养土壤酵母多样性及其预测因子的研究。
