该协议将演示光谱聚焦SRS显微镜的实现和优化，以及如何将其用于实时激励拉曼组织学应用。该技术的主要优点是，一旦仪器正确对齐，就可以快速处理样品，因为SRS不需要组织处理和染色。该协议适用于其他SRS应用，而不仅限于组织学。
这些应用包括小分子、药物、细胞和组织。首先为泵浦光束安装一对消色差透镜，以将激光束尺寸放大两倍作为起点。将 100 和 200 毫米的镜头放置在彼此相距约 300 毫米的位置。
然后将泵浦光束对准两个透镜的中心。接下来在第二个透镜后面放置一面镜子，将光束发送到一米多远的墙壁上。使用红外卡跟踪从镜子到墙壁的光束，并检查光束的大小是否发生变化。
如果光束的大小随距离而变化，则准直光束。通过安装一个二向色镜和几个转向镜进行调整，将两个激光束组合在一起。通过监测二向色镜后两个不同位置的光束，优化泵和斯托克斯的空间重叠，这些光束相距约一米。
迭代调整转向镜，然后调整二向色镜，使斯托克斯光束与泵光束对齐。当扫描镜处于停放位置时，通过调整一对转向镜，确保将组合光束发送到激光扫描显微镜扫描镜的中心。在聚光镜之后，使用另一对焦距分别为100毫米和30毫米的透镜，将传输的光束传递到光电二极管上，确保两个光束都包含在光电二极管内。
然后安装两个低通滤波器以阻挡调制的斯托克斯光束。在斯托克斯光束路径中放置一个光束采样器，以拾取10%的光束并将其发送到快速光电二极管以检测80兆赫兹脉冲序列。取扇出缓冲器的一个输出，并用带通滤波器对其进行滤波，以获得20兆赫兹的正弦波。
然后使用RF衰减器将输出峰峰值电压调节至约500毫伏。将得到的输出发送到移相器，从而允许使用电压源对RF相位进行微调。将此输出发送到RF功率放大器，并将放大器的输出连接到EOM。
在疏通斯托克斯光束后，通过在光束路径中放置光电二极管来优化第一个EOM的调制深度。调整EOM电压和四分之一波片，直到调制深度看起来令人满意。在二向色镜后放置光电二极管以检测激光束。
首先阻挡斯托克斯光束，然后放大示波器上的一个泵脉冲峰值。放置垂直光标，用示波器标记此峰值的时间位置。现在阻挡泵梁，并疏通斯托克斯梁。
转换延迟级，将示波器上的峰值位置与上一步中的标记位置临时匹配。通过计算匹配两束光束所需的延迟距离，然后拉长较快光束的光束路径或缩短较慢光束的光束路径。接下来，用DMSO和双面胶带作为垫片准备显微镜载玻片样品，以将样品固定在载玻片和盖玻片之间。
将样品放在显微镜上，盖玻片面朝向显微镜物镜，并在明场照明下观察I片中的样品。在玻璃胶带界面处的顶层和底层气泡处找到样品的焦点，然后将焦点移动到胶带的两层之间。接下来将可调谐光束输出设置为798纳米。
根据聚光镜的光通量，将目标焦点处的泵浦和斯托克斯光束的光功率调整为约40毫瓦。然后在MATLAB中打开扫描图像，然后单击标有焦点的按钮开始扫描。在电流扫描器之前调整转向镜，将直流信号居中放在通道一个显示屏上。
移动电动延迟级，并密切观察通道二显示屏上显示的锁相输出。最后调整时间延迟以最大化交流信号强度。调整二向色镜，使 SRS 信号在交流通道上居中。
然后调整锁相放大器的相位，使信号最大化。将样品载玻片安装到显微镜上，并在样品聚焦时将两束光束的功率调整到每个光束约40毫瓦后，如前所述。从 MATLAB 打开扫描图像。
然后通过扫描对应于DMSO的2， 913反厘米拉曼峰的延迟级来找到最大SRS信号。获取对应于DMSO的2， 913反厘米拉曼峰的SRS图像。在 ImageJ 中打开图像，然后选择帧中心的一个小区域。
使用测量函数可以计算所选区域中值的均值和标准差。对于频率访问校准，请保存高光谱扫描，延迟级范围覆盖DMSO的2，913和2，994反厘米拉曼峰。然后保存与高光谱数据集相对应的载物台位置。
对载物台位置和拉曼位移在 2、913 和 2、994 反厘米处执行线性回归。使用线性回归方程，将延迟位置转换为相应的拉曼频率。为了校准光谱分辨率，根据先前的位置估计载物台位置，由于插入棒而增加光程长度。
重新对齐光束空间重叠，因为添加玻璃棒时光束的轻微偏差。在第一个EOM之后，在浸泡光束路径中安装一个偏振分束器，一个四分之一波板和第二个EOM。拔下第二个 EOM 的信号输入，然后将信号输入插入第一个 EOM，然后将其打开。
通过将光束发送到第一个EOM，将斯托克斯光束调制为20兆赫兹。调整第一个EOM的倾斜度和位置，以确保光束通过EOM晶体居中。用双面胶带，显微镜载玻片和盖玻片制备组织载玻片样品。
将样品放在显微镜上，盖玻片面朝向显微镜物镜。对于落射模式SRS成像，在光束进入显微镜之前安装一个半波板，以改变进入显微镜的光束的偏振。在物镜上方放置一个偏振分束器，以使去极化的背面反射光束到达探测器。
接下来，使用75毫米消色差透镜和30毫米非球面透镜将背散射光子从物镜的后孔径传递到光电探测器。安装探测器以收集偏振分束器所引导的背散射光。然后安装一个滤波器，以阻止调制光束进入探测器。
改变棒长度会影响光谱分辨率。当不使用玻璃啁啾棒时，DMSO的两个拉曼峰根本无法分辨。玻璃啁啾棒数量的增加开始在令人满意的点上解析两个峰值。
匹配的啁啾声可解析两个峰值，并可用于根据频率校准载物台位置。用于对DMSO光谱进行成像的正交偏振的两个时间延迟脉冲序列显示了具有可接受调制深度和时间分离的SRS激励之间的时间延迟。相反，较差的双色SRS相移会产生倒置或负峰。
此处显示了在2，850和2，930反向厘米的离体小鼠脑组织处的实时双色SRS成像。原始脂质和蛋白质图像被颜色编码以产生描绘脂质和蛋白质贡献的单一图像。还进行了假苏木精和曙红复色，以模仿苏木精和曙红染色用于病理学应用。
空间时间重叠和空间分辨率优化是SRS空间聚焦方法最重要的步骤。该方法一般适用于其他泵浦探针显微镜实验，如瞬态吸收显微镜。该方法还允许对细胞和组织中的非荧光分子进行成像。
这里介绍的方法加快了图像采集时间，以便将来在临床上翻译受激拉曼组织学。
