高度多重振动成像提供了一种单次光学方法，以亚细胞分辨率询问组织中的多种蛋白质标记物。该平台提供了生物系统蛋白质相互作用的全面图片。该技术的主要优点是其无周期的多重性。
该技术特别适用于循环策略不能很好地发挥作用的应用，例如在厚组织切片中。该方法能够原位表征单个细胞，以了解复杂系统的结构，例如构建组织图谱，表型肿瘤微环境和分析脑回路。首先，在PHA 0.3的PBS缓冲液中制备约0.1摩尔碳酸氢钠，用作共轭缓冲液并将其储存在四摄氏度。
然后在无水二甲基亚砜中制备三毫摩尔正羟基琥珀酰亚胺酯功能MARS探针溶液。将抗体固体溶解在偶联缓冲液中，浓度为每毫升两毫克。对于溶解在其他缓冲液中的抗体，将它们浓缩在离心过滤器中，然后加入到偶联缓冲液中，浓度为每毫升一到两毫克。
为了进行二抗的偶联反应，在搅拌下缓慢地向玻璃瓶中的抗体溶液中加入15倍摩尔过量的染料溶液，并在室温下搅拌孵育反应混合物一小时。为了进行纯化，通过在50毫升管中将10毫升凝胶过滤树脂粉末加入40毫升PBS缓冲液中来制备浆料。将溶液保持在90摄氏度的水浴中一小时。
然后倾析上清液，加入PBS至40毫升，并将浆料储存在4摄氏度。将尺寸排阻柱与浆液一起包装至10至15厘米的高度，然后用约10毫升PBS冲洗并洗涤柱以进一步包装树脂。随后，将偶联反应混合物移液到色谱柱中。
加载反应混合物后，立即加入一毫升PBS作为洗脱缓冲液。然后，通过观察柱上的颜色或通过测量280纳米处的吸光度来收集共轭溶液的淋洗液。使用离心过滤器，将收集的溶液浓缩至每毫升一至两毫克。
使用疏水笔，在载玻片上的组织部分周围绘制一个边界。然后将组织用0.3至0.5%PBST孵育10分钟，并用封闭缓冲液孵育30分钟。为了制备初级染色溶液，将所有一抗以所需浓度加入200至500微升染色缓冲液中。
将初级染色溶液以13， 000倍G离心5分钟，如果出现沉淀物，则使用上清液。然后将组织在一抗溶液中以四摄氏度孵育一至两天。用0.3至0.5%PBST在室温下在载玻片立罐中洗涤载玻片三次，并确保组织浸入溶液中。
之后，将组织在200至500微升封闭缓冲液中孵育30分钟。为了制备二次染色溶液，将所有二抗加入200至500毫升具有所需浓度的染色缓冲液中。然后将二次染色溶液以13， 000倍G离心五分钟，如果出现沉淀物，则使用上清液。
接下来，将组织在200至500微升的二抗溶液中以4摄氏度孵育一至两天。然后在室温下用0.3至0.5%PBST洗涤载玻片两次，每次洗涤五分钟。此外，用200至500微升DAPI溶液孵育30分钟。
再次，在室温下用PBS洗涤载玻片三次，每次洗涤五分钟，并用玻璃滴管将漂浮的组织切片转移到载玻片上。用纸巾刷铺开纸巾，并在需要时用湿巾清洁周围。随后，将组织安装在一滴带有玻璃盖玻片的防褪色试剂中，并用指甲油固定。
要执行多通道 eprSRS 成像，请在激光控制面板上将泵浦光束的激光功率设置为 10 至 40 毫瓦，将斯托克斯光束设置为 40 至 80 毫瓦。然后将像素停留时间设置为两到四微秒，并在显微镜软件上使用多个帧，平均为10到20帧。此外，将锁相放大器的时间常数设置为像素停留时间的一半。
通过免疫标记对不同蛋白质标志物和HeLa细胞多聚甲醛固定小鼠脑皮层和湿润肾FFPE组织进行拉曼染料成像。具有α-微管蛋白的HeLa细胞的免疫- eprSRS成像揭示了精细的亚细胞结构，如微管。小鼠脑组织中MARS 2145染色星形胶质细胞和MARS 2228染色小脑颗粒神经元的eprSRS成像显示出亚细胞分辨率的三维模式。
对冷冻小鼠胰岛组织上的激素和转录因子进行七色SRS荧光串联成像。获得的图像显示出良好的对比度和正确的图案。对多聚甲醛固定小鼠小脑组织上的细胞类型标记物进行8色SRS荧光串联成像。
鉴定出不同类型的细胞，如小脑颗粒神经元，浦肯野神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞和GABA能神经元。该过程可以进一步与组织清除相结合，以在厚的完整组织中进行高度多重的蛋白质成像。我们的团队为其开发了一种拉曼染料定制的组织清除方案。
