测量 果蝇 光感受器中光色素水平的电生理学方法

该方案特别适用于视觉缺陷果蝇突变体的遗传筛选。这是因为它们允许检测果蝇光转导中的微小异常，特别是在光色素水平和分层同伴相关功能方面。该技术在体内意义深远，易于执行且高度稳健，能够检测光转导蛋白活性的微小变化。

在我看来，在保持生存能力的同时修复苍蝇可能是这种方法的关键部分。打开计算机并打开 Clampex 软件。打开放大器和 Master-8 脉冲发生器，然后打开氙气灯和快门控制器。

打开拉拔器，在拉拔器中放置玻璃毛细管并拉动它。从拉拔器上取下玻璃毛细管。使用细长的尖端注射器用过滤的铃声溶液填充玻璃毛细管。

将电极丝插入玻璃毛细管。确保毛细管内的溶液与银线接触。将电极支架插入两个电极显微操纵器中。

打开烙铁的电源。将电流设置为大约 2.25 安培。该电流应将0.25毫米铂铱丝加热到约55至56摄氏度。

将一滴熔化温度较低的蜡放在烙铁上。麻醉瓶内的苍蝇。将麻醉的苍蝇倒入卧铺容器中，选择一只苍蝇并用培养皿覆盖其余的苍蝇。

用锋利的镊子小心地抓住苍蝇的翅膀，然后将其放在苍蝇支架上。在苍蝇支架上，将苍蝇侧卧，背部朝向手。用镊子将苍蝇从翅膀上抬起，然后用烙铁将其翅膀固定在苍蝇支架上。

使用烙铁用蜡将苍蝇的背部连接到支架表面。将烙铁的尖端降低到腿的连接点，然后将蜡熔化以将所有腿覆盖在一起。在颈部区域的头部和颈部之间滴一小滴蜡。

将苍蝇支架放在磁铁块上的黑暗法拉第笼中，并确保苍蝇距离光导末端约 5 毫米。使用显微操纵器将记录电极放在苍蝇的眼睛上方，将接地电极放在苍蝇的上背部。然后使用显微操纵器将接地电极插入苍蝇的背面。

将记录电极插入苍蝇眼的外周，最好使用微型操纵器。关闭法拉第笼并关闭房间内的灯，以适应黑暗五分钟。输入从脉冲持续时间 500 米/秒、脉冲间隔 60 秒和脉冲数设置为 6 开始的参数。

要测量PDA，请将Master-8脉冲发生器设置为TRAIN模式，然后使用橙色滤光片发出最大强度的五秒光脉冲。检查电压响应。用宽带蓝色滤光片替换橙色滤光片，并以最大强度发出三个 5 秒的光脉冲。

检查电压响应。在黑暗中等待至少 60 秒。将蓝色过滤器替换为以前的橙色过滤器。

然后以 60 秒的间隔给出两个 5 秒的光脉冲。检查电压响应。为了测量ERP M电位，请发出连续的蓝光脉冲，直到达到稳态电压响应。

使用 20 纳米带通滤光片提供波长在 350 至 700 纳米之间的短暂强光闪光。然后测量M电位响应的M1相的峰值幅度，它反映了光平衡下该特定波长下间视紫红质的吸收。评估不同突变果蝇的PDA反应。

野生型苍蝇在强烈的蓝光刺激后，在黑暗中表现出饱和的去极化，表现为长时间的角膜负ERG。以下蓝灯产生叠加在PDA上的小响应，缺少开和关瞬变。在具有异常光色素生物发生（如ninaE）的突变果蝇中，电压响应在强烈的蓝光刺激后恢复到基线，并且对额外蓝光的反应未受到抑制，并显示出正常的开关瞬变。

苍蝇的野生型ERP是通过相同的协议获得的，但在PDA期间应用了强烈的绿色闪光。此绿色闪光触发 ERP 并抑制 PDA。M电位是通过蓝色照明后的绿色闪光获得的，而不是通过野生型苍蝇蓝色照明后的蓝色闪光获得的。

该方案在野生型，光色素亚型突变体ninaE和具有正常光色素水平norpA的光转导缺陷突变体中重复。通过不同光谱和光平衡光谱的光度测量计算了苍蝇视紫红质和视紫红质的相对吸收光谱。对于苍蝇的生存来说，通过避免过热来注意蜡的粘度很重要。

该程序适用于遗传和通过筛选有缺陷的视觉突变体。随机分离和识别视觉突变的方法可能有助于发现参与果蝇光转导的新蛋白质和机制。PDA协议能够隔离重要和新颖的视觉机制。

否则，参与可能不会被发现，甚至没有预料到。