Este protocolo es particularmente adecuado para la detección genética de mutantes de Drosophila visualmente defectuosos. Esto se debe a que permiten la detección de incluso pequeñas anomalías en la fototransducción de Drosophila, particularmente en los niveles de fotopigmento y las funciones relacionadas con los pares de nivel. Esta técnica es profunda in vivo, es fácil de ejecutar y altamente robusta, permitiendo la detección de pequeños cambios en la actividad de las proteínas de fototransducción.
En mi opinión, arreglar las moscas mientras se mantiene la viabilidad es probablemente la parte crítica de este método. Encienda el ordenador y abra el software Clampex. Encienda el amplificador y el generador de pulsos Master-8 y, a continuación, encienda la lámpara de xenón y el controlador del obturador.
Encienda el extractor y coloque un capilar de vidrio en el extractor y tire de él. Retire el capilar de vidrio del extractor. Llene el capilar de vidrio con una solución de ringer filtrada usando una jeringa de punta alargada.
Inserte el electrodo de alambre en el capilar de vidrio. Asegúrese de que la solución dentro del capilar esté en contacto con el alambre de plata. Inserte los soportes de electrodos en los dos micromanipuladores de electrodos.
Encienda la fuente de alimentación del soldador. Ajuste la corriente a aproximadamente 2,25 amperios. Esta corriente debería calentar el filamento de platino-iridio de 0,25 milímetros a aproximadamente 55 a 56 grados centígrados.
Coloque una gota de cera con una temperatura de fusión baja en el soldador. Anestesia las moscas dentro de la botella. Vierta las moscas anestesiadas en el recipiente para dormir, elija una mosca y cubra el resto de las moscas con una placa de Petri.
Sostenga cuidadosamente la mosca por sus alas con una pinza afilada y colóquela en el portamoscas. En el portamoscas, coloque la mosca acostada de lado con la espalda hacia la mano. Usando pinzas, levante la mosca de sus alas y fije sus alas al portamoscas usando el soldador.
Conecte la espalda de la mosca a la superficie del soporte con cera utilizando el soldador. Baje la punta del soldador hasta el punto de unión de las patas, luego derrita la cera para cubrir todas las piernas juntas. Coloque una pequeña gota de cera entre la cabeza y el cuello en el área del cuello.
Coloque el portamoscas en una jaula de Faraday oscura sobre un bloque magnético y asegúrese de que la mosca esté aproximadamente a cinco milímetros del final de la guía de luz. Coloque el electrodo de grabación sobre el ojo de la mosca y el electrodo de tierra sobre la parte superior de la espalda de la mosca utilizando los micromanipuladores. Luego inserte el electrodo de tierra en la parte posterior de la mosca usando los micromanipuladores.
Inserte el electrodo de grabación en la periferia exterior del ojo de la mosca, preferiblemente utilizando los micromanipuladores. Cierre la jaula de Faraday y apague las luces de la habitación para permitir la adaptación a la oscuridad durante cinco minutos. Introduzca los parámetros a partir de una duración de pulso de 500 metros por segundo, un intervalo de pulso de 60 segundos y el número de pulsos establecido en seis.
Para medir el PDA, ajuste el generador de impulsos Master-8 en modo TRAIN, luego dé un pulso de luz de cinco segundos de intensidad máxima usando un filtro naranja. Compruebe la respuesta de voltaje. Reemplace el filtro naranja con un filtro azul de banda ancha y dé tres pulsos de luz de 5 segundos a la intensidad máxima.
Compruebe la respuesta de voltaje. Espere al menos 60 segundos en la oscuridad. Reemplace el filtro azul con el filtro naranja anterior.
Luego dé dos pulsos de luz de 5 segundos con intervalos de 60 segundos. Compruebe la respuesta de voltaje. Para medir el potencial M de ERP, proporcione un pulso de luz azul continuo hasta que se alcance una respuesta de voltaje de estado estacionario.
Dé un breve destello de luz intensa de una longitud de onda entre 350 y 700 nanómetros utilizando un filtro de paso de banda de 20 nanómetros. Luego mida la amplitud máxima de la fase M1 de la respuesta del potencial M, que refleja la absorción de metarodopsina en esta longitud de onda específica en el fotoequilibrio. Las respuestas PDA se evaluaron para diferentes moscas mutantes.
Las moscas de tipo salvaje mostraron una despolarización saturada en la oscuridad que apareció como ERG corneal negativo prolongado, después de una intensa estimulación de la luz azul. Las siguientes luces azules produjeron pequeñas respuestas superpuestas en el PDA, careciendo de los transitorios de encendido y apagado. En moscas mutantes con biogénesis fotopigmentaria anormal como ninaE, la respuesta de voltaje volvió a la línea de base después de una intensa estimulación de luz azul, y la respuesta a una luz azul adicional no se suprimió y mostró transitorios normales de encendido y apagado.
El ERP de tipo salvaje de la mosca se obtiene por el mismo protocolo, pero se aplica un destello verde intenso durante la PDA. Este destello verde provoca el ERP y suprime el PDA. El potencial M se obtuvo por el destello verde después de la iluminación azul, pero no por un destello azul después de la iluminación azul en la mosca de tipo salvaje.
Este protocolo se repitió en tipo salvaje, en ninaE mutante hipomorfo fotopigmentario y en mutante deficiente en fototransducción con niveles normales de fotopigmento norpA. Los espectros de absorción relativa de rodopsina mosca y metarodopsina se calcularon a partir de mediciones fotométricas del espectro diferente y el espectro de fotoequilibrio. Es importante para la supervivencia de las moscas prestar atención a la viscosidad de la cera absteniéndose de sobrecalentarse.
Este procedimiento es adecuado para la genética y a través de la detección de mutantes visuales defectuosos. Los métodos que aíslan e identifican mutaciones visuales al azar pueden facilitar el descubrimiento de nuevas proteínas y mecanismos implicados en la fototransducción de Drosophila. El protocolo PDA permitió el aislamiento de mecanismos visuales importantes y novedosos.
La participación probablemente no habría sido descubierta o incluso anticipada de otra manera.
