이 프로토콜은 시각적으로 결함이 있는 초파리 돌연변이체의 유전자 스크리닝에 특히 적합합니다. 이는 초파리 광변환의 작은 이상, 특히 광색소 수준 및 계층 동료 관련 기능에서도 감지할 수 있기 때문입니다. 이 기술은 생체 내에서 심오하며 실행하기 쉽고 매우 견고하여 광변환 단백질 활성의 작은 변화를 감지할 수 있습니다.
제 생각에는 생존력을 유지하면서 파리를 고정하는 것이 아마도이 방법의 중요한 부분 일 것입니다. 컴퓨터를 켜고 Clampex 소프트웨어를 엽니다. 앰프와 Master-8 펄스 발생기를 켠 다음 크세논 램프와 셔터 컨트롤러를 켭니다.
풀러를 켜고 풀러에 유리 모세관을 놓고 당깁니다. 풀러에서 유리 모세관을 제거합니다. 길쭉한 팁 주사기를 사용하여 여과 된 링거 용액으로 유리 모세관을 채 웁니다.
와이어 전극을 유리 모세관에 삽입합니다. 모세관 내의 용액이 은선과 접촉하는지 확인하십시오. 전극 홀더를 두 개의 전극 마이크로 매니퓰레이터에 삽입합니다.
납땜 인두의 전원 공급 장치를 켭니다. 전류를 약 2.25암페어로 설정합니다. 이 전류는 0.25mm 백금-이리듐 필라멘트를 섭씨 약 55도에서 56도까지 가열해야 합니다.
납땜 인두에 녹는 온도가 낮은 왁스 한 방울을 놓습니다. 병 안의 파리를 마취하십시오. 마취 된 파리를 침목 용기에 붓고 파리 하나를 선택하고 나머지 파리를 페트리 접시로 덮으십시오.
날카로운 핀셋을 사용하여 날개로 파리를 조심스럽게 잡고 플라이 홀더에 놓습니다. 플라이 홀더에서 플라이를 옆으로 눕히고 등을 손으로 향하게 합니다. 핀셋을 사용하여 날개에서 파리를 들어 올리고 납땜 인두를 사용하여 날개를 플라이 홀더에 고정하십시오.
납땜 인두를 사용하여 왁스로 플라이의 등을 스탠드 표면에 연결합니다. 납땜 인두의 끝을 다리의 연결 지점까지 내린 다음 왁스를 녹여 모든 다리를 함께 덮습니다. 목 부위의 머리와 목 사이에 작은 왁스 방울을 놓습니다.
플라이 홀더를 자석 블록의 어두운 패러데이 케이지에 놓고 플라이가 라이트 가이드 끝에서 약 5mm 떨어져 있는지 확인합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 기록 전극을 파리의 눈 위에 놓고 접지 전극을 파리의 등 위쪽에 놓습니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 접지 전극을 플라이 뒤쪽에 삽입합니다.
기록 전극을 파리의 눈의 바깥 둘레에 삽입하는 것이 바람직하며, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하는 것이 좋습니다. 패러데이 케이지를 닫고 방의 조명을 꺼서 5 분 동안 어둠에 적응할 수 있도록하십시오. 초당 500미터의 펄스 지속 시간, 60초의 펄스 간격 및 6으로 설정된 펄스 수에서 시작하는 매개변수를 입력합니다.
PDA를 측정하려면 Master-8 펄스 발생기를 TRAIN 모드로 설정 한 다음 주황색 필터를 사용하여 최대 강도의 5 초 광 펄스를 제공합니다. 전압 응답을 확인하십시오. 주황색 필터를 광대역 파란색 필터로 교체하고 최대 강도로 3개의 5초 광 펄스를 제공합니다.
전압 응답을 확인하십시오. 어둠 속에서 60 초 이상 기다리십시오. 파란색 필터를 이전 주황색 필터로 교체합니다.
그런 다음 60 초 간격으로 두 개의 5 초 광 펄스를줍니다. 전압 응답을 확인하십시오. ERP M 전위를 측정하려면 정상 상태 전압 응답에 도달할 때까지 연속 청색광 펄스를 제공합니다.
20 나노 미터 대역 통과 필터를 사용하여 350에서 700 나노 미터 사이의 파장의 짧고 강렬한 빛을 제공합니다. 그런 다음 M-전위 응답의 M1 위상의 피크 진폭을 측정하는데, 이는 광평형에서 이 특정 파장에서의 메타로돕신 흡수를 반영합니다. PDA 반응은 상이한 돌연변이 파리에 대해 평가되었다.
야생형 파리는 강렬한 청색광 자극 후 장기간의 각막 음성 ERG로 나타난 어둠 속에서 포화 탈분극을 보였다. 다음 청색광은 PDA에 겹쳐진 작은 응답을 생성했으며 켜기 및 끄기 과도 현상이 없었습니다. ninaE와 같은 비정상적인 광 색소 생물 발생을 가진 돌연변이 파리에서 전압 반응은 강렬한 청색광 자극 후 기준선으로 돌아 왔으며 추가 청색광에 대한 반응은 억제되지 않았으며 정상적인 켜기 및 끄기 과도 상태를 보였습니다.
파리의 야생형 ERP는 동일한 프로토콜로 얻어 지지만 PDA 중에 강렬한 녹색 플래시가 적용됩니다. 이 녹색 섬광은 ERP를 유도하고 PDA를 억제합니다. M- 전위는 파란색 조명 후 녹색 플래시에 의해 얻어졌지만 야생형 플라이에서 파란색 조명 후 파란색 플래시에 의해 얻어지지 않았습니다.
이 프로토콜은 야생형, 광색소 하이포모프 돌연변이 ninaE, 및 정상 광색소 수준 norpA를 갖는 광변환 결핍 돌연변이에서 반복되었습니다. 플라이로돕신 및 메타로돕신의 상대 흡수 스펙트럼은 상이한 스펙트럼 및 광평형 스펙트럼의 측광 측정으로부터 계산되었다. 파리의 생존을 위해서는 과열을 자제하여 왁스 점도에주의를 기울이는 것이 중요합니다.
이 절차는 유전 적 및 결함이있는 시각 돌연변이의 스크리닝을 통해 적합합니다. 시각적 돌연변이를 무작위로 분리하고 식별하는 방법은 초파리 광형질도입과 관련된 새로운 단백질 및 메커니즘의 발견을 용이하게 할 수 있습니다. PDA 프로토콜은 중요하고 새로운 시각적 메커니즘의 분리를 가능하게했습니다.
참여는 아마도 발견되지 않았거나 그렇지 않으면 예상되지 않았을 것입니다.
