Этот протокол особенно подходит для генетического скрининга визуально дефектных мутантов Drosophila. Это связано с тем, что они позволяют обнаруживать даже небольшие аномалии в фототрансдукции дрозофилы, особенно в уровнях фотопигмента и многоуровневых функциях, связанных со сверстниками. Этот метод глубок in vivo, прост в выполнении и очень надежен, что позволяет обнаруживать небольшие изменения в активности белков фототрансдукции.
На мой взгляд, фиксация мух при сохранении жизнеспособности, вероятно, является критической частью этого метода. Включите компьютер и откройте программное обеспечение Clampex. Включите усилитель и генератор импульсов «Мастер-8», затем включите ксеноновую лампу и контроллер затвора.
Включите съемник, поместите стеклянный капилляр в съемник и потяните его. Снимите стеклянный капилляр со съемника. Наполните стеклянный капилляр фильтрованным раствором рингера с помощью шприца с удлиненным наконечником.
Вставьте проволочный электрод в стеклянный капилляр. Убедитесь, что раствор внутри капилляра находится в контакте с серебряной проволокой. Вставьте держатели электродов в два электродных микроманипулятора.
Включите питание паяльника. Установите ток примерно на 2,25 ампера. Этот ток должен нагревать 0,25-миллиметровую платино-иридиевую нить примерно до 55-56 градусов по Цельсию.
Поместите каплю воска с низкой температурой плавления на паяльник. Обезболивайте мух внутри бутылки. Вылейте обезболенных мух в спальный контейнер, выберите одну муху и накройте остальных мух чашкой Петри.
Осторожно держите муху за крылья с помощью острого пинцета и поместите ее на держатель мухи. На держателе мухи поместите муху, лежащую на бок спиной к руке. Используя пинцет, поднимите муху с крыльев и закрепите ее крылья на держателе мухи с помощью паяльника.
Соедините спинку мухи с поверхностью подставки воском с помощью паяльника. Опустите кончик паяльника к точке соединения ножек, затем расплавите воск, чтобы покрыть все ноги вместе. Поместите небольшую каплю воска между головой и шеей в область шеи.
Поместите держатель мухи в темную клетку Фарадея на магнитный блок и убедитесь, что муха находится примерно в пяти миллиметрах от конца световода. Поместите записывающий электрод над глазом мухи, а наземный электрод над верхней частью спины мухи с помощью микроманипуляторов. Затем вставьте заземляющий электрод в заднюю часть мухи с помощью микроманипуляторов.
Вставьте записывающий электрод во внешнюю периферию глаза мухи, предпочтительно с помощью микроманипуляторов. Закройте клетку Фарадея и выключите свет в комнате, чтобы приспособиться к темноте в течение пяти минут. Введите параметры, начиная с длительности импульса 500 метров в секунду, интервала импульсов 60 секунд, а количество импульсов установлено на шесть.
Для измерения КПК установите генератор импульсов Мастер-8 в режим TRAIN, затем подайте пятисекундный световой импульс максимальной интенсивности с помощью оранжевого фильтра. Проверьте отклик напряжения. Замените оранжевый фильтр широкополосным синим фильтром и дайте три 5-секундных световых импульса с максимальной интенсивностью.
Проверьте отклик напряжения. Подождите не менее 60 секунд в темноте. Замените синий фильтр предыдущим оранжевым фильтром.
Затем дают два 5-секундных световых импульса с 60-секундными интервалами. Проверьте отклик напряжения. Для измерения М-потенциала ERP дайте непрерывный импульс синего света до тех пор, пока не будет достигнута реакция напряжения в устойчивом состоянии.
Дайте короткую интенсивную вспышку света длиной волны от 350 до 700 нанометров с помощью 20-нанометрового полосового фильтра. Затем измеряют пиковую амплитуду М1 фазы М-потенциального отклика, которая отражает поглощение метарходопсина на этой конкретной длине волны в фотоэквилибриуме. Ответы КПК были оценены для различных мух-мутантов.
Мухи дикого типа показали насыщенную деполяризацию в темноте, которая выглядела как длительный отрицательный ERG роговицы после интенсивной стимуляции синего света. Следующие синие огни производили небольшие отклики, наложенные на КПК, не имея переходных процессов включения и выключения. У мутантных мух с аномальным биогенезом фотопигмента, таким как нинаЕ, реакция напряжения вернулась к исходному уровню после интенсивной стимуляции синим светом, а реакция на дополнительный синий свет не подавлялась и показывала нормальное включение и выключение переходных процессов.
ERP дикого типа мухи получается по тому же протоколу, но во время КПК применяется интенсивная зеленая вспышка. Эта зеленая вспышка вызывает ERP и подавляет КПК. М-потенциал был получен зеленой вспышкой после синего освещения, но не синей вспышкой после синего освещения у мухи дикого типа.
Этот протокол повторялся в диком типе, в гипоморфном мутанте фотопигмента ninaE и в фототрансдукционно-дефицитном мутанте с нормальным уровнем фотопигмента norpA. Спектры относительного поглощения родопсина мух и метародопсина были рассчитаны на основе фотометрических измерений различного спектра и спектра фотоэквилибриума. Для выживания мух важно обращать внимание на вязкость воска, воздерживаясь от перегрева.
Эта процедура подходит для генетического и скрининга дефектных визуальных мутантов. Методы, которые случайным образом изолируют и идентифицируют визуальные мутации, могут способствовать открытию новых белков и механизмов, участвующих в фототрансдукции дрозофилы. Протокол PDA позволил изолировать важные и новые визуальные механизмы.
Иначе об участии, вероятно, не было бы обнаружено или даже не предполагалось.
