פרוטוקול זה מתאים במיוחד לבדיקה גנטית של מוטציות דרוזופילה פגומות מבחינה חזותית. הסיבה לכך היא שהם מאפשרים זיהוי אפילו של חריגות קטנות בפוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה, במיוחד ברמות פוטופיגמנט ובתפקודים הקשורים לעמיתים. טכניקה זו היא עמוקה in vivo, היא קלה לביצוע וחזקה מאוד, ומאפשרת לזהות שינויים קטנים בפעילות של חלבוני פוטו-טרנסדוקציה.
לדעתי, תיקון הזבובים תוך שמירה על הכדאיות הוא כנראה החלק הקריטי בשיטה זו. הפעל את המחשב ופתח את תוכנת Clampex. הפעל את המגבר ואת מחולל הדופק Master-8, ולאחר מכן הפעל את מנורת הקסנון ואת בקר התריס.
הפעל את המושך והנח נימי זכוכית במושך ומשוך אותו. הסר את נימי הזכוכית מהמושך. מלאו את נימי הזכוכית בתמיסת צלצול מסונן באמצעות מזרק קצה מוארך.
הכנס את אלקטרודת החוט לתוך נימי הזכוכית. ודא כי הפתרון בתוך נימי הוא במגע עם חוט הכסף. הכנס את מחזיקי האלקטרודות לתוך שני המיקרומניפולטורים של האלקטרודות.
הפעל את אספקת החשמל של ברזל הלחמה. הגדר את הזרם לכ-2.25 אמפר. זרם זה אמור לחמם את נימה פלטינה-אירידיום בגודל 0.25 מ"מ לכ-55 עד 56 מעלות צלזיוס.
מניחים טיפת שעווה עם טמפרטורת התכה נמוכה על ברזל הלחמה. מרדימים את הזבובים בתוך הבקבוק. יוצקים את הזבובים המורדמים למיכל השינה, בוחרים זבוב אחד ומכסים את שאר הזבובים בצלחת פטרי.
החזיקו בזהירות את הזבוב בכנפיו באמצעות פינצטה חדה והניחו אותו על מחזיק הזבוב. על מחזיק הזבוב, הניחו את הזבוב שוכב על צדו כשגבו לכיוון היד. באמצעות פינצטה, הרימו את הזבוב מכנפיו וקבעו את כנפיו למחזיק הזבוב באמצעות ברזל הלחמה.
חברו את גב הזבוב למשטח המעמד באמצעות שעווה באמצעות מגהץ הלחמה. מורידים את קצה הברזל המולחם לנקודת החיבור של הרגליים, ואז ממיסים את השעווה כדי לכסות את כל הרגליים יחד. מניחים טיפה קטנה של שעווה בין הראש לצוואר באזור הצוואר.
הניחו את מחזיק הזבוב בכלוב פאראדיי חשוך על גוש מגנט וודאו שהזבוב נמצא כחמישה מילימטרים מקצה מדריך האור. מקם את אלקטרודת ההקלטה מעל עין הזבוב ואת אלקטרודת הקרקע מעל גבו העליון של הזבוב באמצעות המיקרומניפולטורים. לאחר מכן הכנס את אלקטרודת הקרקע לחלק האחורי של הזבוב באמצעות המיקרומניפולטורים.
הכנס את אלקטרודת ההקלטה לפריפריה החיצונית של עין הזבוב, רצוי באמצעות המיקרו מניפולטורים. סגרו את כלוב הפאראדיי וכבו את האורות בחדר כדי לאפשר הסתגלות לחושך למשך חמש דקות. הזן את הפרמטרים החל ממשך פולס של 500 מטר לשנייה, מרווח דופק של 60 שניות, ומספר פולסים מוגדר לשש.
למדידת מחשב כף היד, הגדר את מחולל הפולסים Master-8 במצב TRAIN, ולאחר מכן תן פולס אור של חמש שניות בעוצמה מקסימלית באמצעות מסנן כתום. בדוק את תגובת המתח. החלף את המסנן הכתום במסנן כחול פס רחב ותן שלוש פעימות אור של 5 שניות בעוצמה מרבית.
בדוק את תגובת המתח. המתן לפחות 60 שניות בחושך. החלף את המסנן הכחול במסנן הכתום הקודם.
לאחר מכן תן שתי פעימות אור של 5 שניות עם מרווחים של 60 שניות. בדוק את תגובת המתח. למדידת פוטנציאל ה-ERP M, תן פולס אור כחול רציף עד להגעה לתגובת מתח במצב יציב.
תן הבזק אור עז קצר באורך גל שבין 350 ל-700 ננומטר באמצעות מסנן פס של 20 ננומטר. לאחר מכן מדוד את משרעת השיא של שלב M1 של התגובה הפוטנציאלית M, המשקפת את קליטת המטרודופסין באורך גל ספציפי זה בפוטו-שיווי משקל. תגובות ה-PDA הוערכו עבור זבובים מוטנטיים שונים.
זבובים מסוג בר הראו דה-פולריזציה רוויה בחושך שהופיעה כ-ERG שלילי ממושך של הקרנית, בעקבות גירוי אינטנסיבי של אור כחול. האורות הכחולים הבאים הפיקו תגובות קטנות על גבי ה-PDA, וחסרו את ההדלקות והכיבויים. בזבובים מוטנטיים עם ביוגנזה לא תקינה של פוטופיגמנט כגון ninaE, תגובת המתח חזרה לנקודת ההתחלה לאחר גירוי אור כחול אינטנסיבי, והתגובה לאור כחול נוסף לא דוכאה והראתה ארעיות תקינה לסירוגין.
ה-ERP מהסוג הפראי של הזבוב מתקבל על ידי אותו פרוטוקול, אך הבהוב ירוק עז מוחל במהלך ה-PDA. הבזק ירוק זה מעורר את ה-ERP ומדכא את ה-PDA. פוטנציאל ה-M הושג על ידי הפלאש הירוק לאחר התאורה הכחולה, אך לא על ידי הבזק כחול לאחר ההארה הכחולה בזבוב הפראי.
פרוטוקול זה חזר על עצמו בסוג פראי, בפוטופיגמנט היפומורפי מוטנטי ninaE, ובמוטציה חסרת פוטו-טרנסדוקציה עם רמות פוטופיגמנט נורמליות norpA. ספקטרום הקליטה היחסי של רודופסין זבוב ומטרודופסין חושב ממדידות פוטומטריות של הספקטרום השונה וספקטרום הפוטו-שיווי משקל. חשוב להישרדות הזבובים לשים לב לצמיגות השעווה על ידי הימנעות מהתחממות יתר.
הליך זה מתאים לגנטיקה ובאמצעות הקרנה של מוטציות חזותיות פגומות. שיטות המבודדות ומזהות באופן אקראי מוטציות חזותיות עשויות להקל על גילוי חלבונים ומנגנונים חדשים המעורבים בפוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה. פרוטוקול ה-PDA איפשר בידוד של מנגנונים חזותיים חשובים וחדשניים.
סביר להניח שההשתתפות לא הייתה מתגלה או אפילו צפויה אחרת.
