从条件细胞培养基等液体中分离细胞外囊泡可以使研究人员表征前庭货物并探索其细胞内通讯机制。该技术允许从条件细胞培养基中充分分离EV和细胞外蛋白，简单且用户友好。首先将PBS置于37摄氏度的水浴中。
在带有10x和100x物镜的复合显微镜下观察对照和tunicamycin处理的细胞培养瓶。记下烧瓶之间的任何差异。从烧瓶中取出培养基并将其放入50毫升管中。
然后将管以500 G在4摄氏度下离心5分钟，然后将超级清液转移到新管中。将试管以 2000 G 在 4 摄氏度下离心 20 分钟。将超级清液转移到新管中，并将管放在冰上。
取四个15毫升三千道尔顿截止超滤装置，并向每个管中加入5毫升PBS。通过在 4， 000 G 的温度下将装置在 4 摄氏度下离心 10 分钟来灌注过滤器。从单元中除去PBS后，将对照和处理条件下的上清液分成两个超滤单元，每个单元中含有约12.5毫升的培养基。
将试管以4， 000 G在4摄氏度下离心1小时45分钟，或直到每个单元中的浓缩培养基或截留物浓缩至250微升或更低。将截留物从两个控制单元转移到标记的1.5毫升微量离心管中，并从处理过的单元转移到另一个管中。测量每个微量离心管中截留物的总体积。
如果体积小于500微升，则添加0.22微米过滤的PBS，直到最终体积为500微升。将试管放入零下 80 摄氏度的冰箱中。打开自动馏分收集器或 AFC。
将色谱柱从 4 摄氏度中取出，让色谱柱升温至室温。从零下 80 摄氏度的冰箱中取出截留物样品，并将它们放在冰上解冻，在等待时，将八个标记的 1.5 毫升管放在 AFC 转盘中，盖子朝内。将色谱柱插入AFC，条形码面向阅读器，并调整设置以收集8个馏分，每个部分500微升，缓冲液体积为默认值。
然后验证屏幕上的说明以开始收集。在储存缓冲液被完全吸收到柱基质的顶部之后。通过向色谱柱中添加15毫升PBS开始冲洗色谱柱。
不要过早添加PBS，因为它会稀释存储缓冲液并防止充分冲洗。在所有15毫升PBS被基质吸收之前，单击确定停止冲洗，并用微量移液管从柱基质顶部去除任何残留的PBS。请勿触摸矩阵。
将 500 微升样品添加到色谱柱中心，然后单击 OK 开始运行。样品完全吸收到基质中后，立即向色谱柱中加入8毫升PBS。AFC自动将空隙体积分散到转盘的中心，然后收集所有八个部分，每个部分500微升。
跑步后，从旋转木马上取出碎屑并将它们放在冰上。然后从轮播中心移除空白体积。接下来，向色谱柱中加入10毫升PBS，以洗涤色谱柱上的任何残留样品。
一旦悔改的样品完全冲洗，向色谱柱中加入15毫升PBS。当最终PBS被基质吸收时，在色谱柱基质的中心加入500微升0.5摩尔氢氧化钠。然后，随着氢氧化钠被吸收，向色谱柱中加入30毫升PBS，使其冲洗通过。
完成所有样品后，通过向色谱柱中加入15毫升0.05%叠氮化钠来保存色谱柱以备后用。在柱基质顶部留下约5毫升叠氮化钠。从AFC上取下色谱柱并安装顶部和底部盖子，然后将色谱柱置于4摄氏度下进行储存。
构建超滤单元。每个样品获得两毫升，三千道尔顿截止超滤单元。每个单元由三部分组成，锥形，过滤器和流通式气缸。
正确标记每个部分。在过滤器部分加入一毫升PBS，并用锥形片盖住盖子。将超滤单元锥面朝上在 3， 500 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟，然后从流通筒中取出过滤后的 PBS。
将超滤装置倒置，在 1000 G 下以 4 摄氏度离心两分钟，以去除任何剩余的 PBS。将每个馏分的四个500微升混合，并将它们添加到超滤装置中。然后将离心柱在4摄氏度下在3， 500 G下重合1小时45分钟，或直到截留液水平为100微升。
拆通气缸并丢弃流通。将超滤装置倒置，在 1000 XG 和 4 摄氏度下离心两分钟。将锥体中的截留物转移到1.5毫升管中，并用0.22微米过滤的PBS使样品体积达到150微升，然后将试管放入零下80摄氏度的冰箱中。
具有代表性的蛋白质单个级分块显示CD9，CD63和CD81的强烈表达。违规一到四，很少或没有表达 违反五到八。在任何级分中均未观察到GM130或钙连接蛋白的表达。
白蛋白仅存在于六至八分之一中。还评估了浓缩EV和蛋白质组分的有效性。在细胞裂解物中观察到CD9和CD63的表达。
所有三种CD蛋白均存在于对照和图尼霉素处理样品的EV级分中，但不存在于蛋白质级分中。肿瘤易感基因101存在于细胞裂解物中，但不存在于EV或蛋白质部分中。仅在细胞裂解物中观察到GM130和calnexin。
在外泌体去除细胞培养基的蛋白质印迹中，EV标志物存在于细胞裂解物中，但不存在于培养基样品中。在蛋白质级分中观察到白蛋白表达，在细胞裂解物中观察到最小表达。TEM观察表明，对照和图尼霉素处理样品的EV级分中存在球形结构。
在两种样品类型的蛋白质级分中均未观察到这些结构。纳米颗粒跟踪分析揭示了EV级分中对照和处理级分的颗粒浓度差异，与对照相比，兔霉素处理中存在的颗粒略多。然而，在蛋白质组分中，相对于电动汽车检测到的颗粒更少。
对于对照和处理条件，具有相同的样品量非常重要，以便轻松比较不同处理的EV。从条件细胞培养基中分离EV后，我们可以通过蛋白质组学RNA测序和脂质组学表征囊泡的蛋白质，RNA和脂质含量。
