조건 세포 배양 배지와 같은 체액에서 세포 외 소포를 분리하면 연구자가 전낭화물을 특성화하고 세포 내 통신 메커니즘을 탐색 할 수 있습니다. 이 기술은 간단하고 사용자 친화적인 컨디셔닝 세포 배양 배지에서 EV와 세포외 단백질을 충분히 분리할 수 있도록 합니다. 시작하려면 PBS를 섭씨 37도 수조에 놓습니다.
대조군 및 튜니카마이신 처리된 세포 배양 플라스크를 10 x 및 100 x 대물 렌즈가 있는 복합 현미경으로 관찰합니다. 플라스크 간의 차이점을 기록해 두십시오. 플라스크에서 배지를 제거하고 50 밀리리터 튜브에 넣습니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 5 분 동안 500G의 튜브를 원심 분리하고 수퍼 액액을 새 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 20 분 동안 2000G의 튜브를 원심 분리합니다. 상청액을 새 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
4 개의 15 밀리리터 3 킬로 달톤 컷오프 울트라 여과 장치를 가져 와서 각 튜브에 5 밀리리터의 PBS를 추가하십시오. 섭씨 4도에서 10 분 동안 4, 000 G의 장치를 원심 분리하여 필터를 프라이밍하십시오. 장치에서 PBS를 제거한 후 대조군 및 처리된 조건에서 상청액을 각각 약 12.5밀리리터의 배지가 있는 두 개의 한외 여과 장치로 나눕니다.
튜브를 섭씨 4도에서 1시간 45분 동안 4, 000 G에서 원심분리하거나 각 단위의 농축된 배지 또는 잔류물이 250 마이크로리터 이하가 될 때까지 원심분리한다. 두 제어 장치의 잔류물을 라벨이 부착된 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 처리된 장치에서 다른 튜브로 옮깁니다. 각 마이크로 원심분리기 튜브에 있는 잔류물의 총 부피를 측정합니다.
부피가 500 마이크로리터 미만인 경우, 최종 부피가 500 마이크로리터가 될 때까지 0.22 마이크로론 여과된 PBS를 첨가한다. 섭씨 영하 80도 냉동고에 튜브를 놓습니다. 자동 분수 수집기 또는 AFC를 켭니다.
섭씨 4도에서 컬럼을 제거하고 컬럼을 실온으로 예열합니다. 영하 80도의 냉동고에서 잔류물 샘플을 꺼내 얼음 위에 올려 해동시킨 후 기다리는 동안 뚜껑이 안쪽을 향하도록 AFC 캐러셀에 라벨이 붙은 1.5밀리리터 튜브 8개를 놓습니다. 바코드가 리더기를 향하도록 열을 AFC에 삽입하고 각각 500마이크로리터의 8개 분획을 수집하고 버퍼 볼륨을 기본값으로 조정하도록 설정을 조정합니다.
그런 다음 화면의 지침을 확인하여 컬렉션을 시작합니다. 저장 버퍼가 컬럼 매트릭스의 상부 부분으로 완전히 흡수된 후. 컬럼에 PBS 15ml를 추가하여 컬럼 세척을 시작합니다.
PBS는 저장 버퍼를 희석시키고 적절한 플러싱을 방지하므로 너무 일찍 추가하지 마십시오. 15 밀리리터의 PBS가 매트릭스에 흡수되기 직전에 확인을 클릭하여 플러싱을 중지하고 마이크로 피펫으로 컬럼 매트릭스 상단에서 잔류 PBS를 제거합니다. 매트릭스를 만지지 마십시오.
컬럼 중앙에 500마이크로리터의 시료를 추가하고 확인을 클릭하여 실행을 시작합니다. 샘플이 매트릭스에 완전히 흡수된 후 즉시 8밀리리터의 PBS를 컬럼에 첨가합니다. AFC는 각각 500 마이크로 리터의 8 개 분획을 모두 수집하기 전에 캐러셀 중앙으로 보이드 볼륨을 자동으로 제거합니다.
실행 후 회전 목마에서 분수를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 캐러셀 중앙에서 빈 공간 볼륨을 제거합니다. 다음으로, 컬럼에 PBS 10ml를 추가하여 컬럼에서 잔류 샘플을 세척합니다.
그리고 회개 한 샘플이 완전히 플러시되면 컬럼에 15 밀리리터의 PBS를 첨가하십시오. 최종 PBS가 매트릭스에 흡수됨에 따라 컬럼 매트릭스의 중앙에 500 마이크로리터의 0.5몰 수산화나트륨을 추가합니다. 그런 다음 수산화나트륨이 흡수되면 컬럼에 PBS 30ml를 넣고 플러시합니다.
모든 샘플이 완료되면 컬럼에 0.05% 아지드화나트륨 15밀리리터를 추가하여 나중에 사용할 수 있도록 컬럼을 보존합니다. 컬럼 매트릭스의 상단에 약 5 밀리리터의 나트륨 아 지드화물을 남겨 둡니다. 보관을 위해 기둥을 섭씨 4도에 놓기 전에 AFC에서 기둥을 제거하고 상단 및 하단 캡을 부착합니다.
울트라 필트레이션 장치를 구성합니다. 샘플당 2밀리리터, 3킬로달톤 컷오프 초여과 장치를 얻습니다. 각 단위는 실린더를 통해서 콘, 여과기 및 교류의 3개 부품으로 구성됩니다.
각 부품에 적절하게 라벨을 붙입니다. 필터 부분에 1 밀리리터 PBS를 추가하고 콘 조각으로 캡을 씌 웁니다. 한외여과 유닛 콘 쪽을 섭씨 4도에서 10분 동안 3, 500 G에서 위로 향하게 하고 여과된 PBS를 실린더를 통한 유동으로부터 제거한다.
한외여과 장치를 거꾸로 뒤집고 섭씨 4도에서 1000G에서 2분 동안 원심분리하여 남아 있는 PBS를 제거합니다. 각 분획의 4 개의 500 마이크로 리터를 결합하여 한외 여과 장치에 첨가하십시오. 그런 다음 원심 분리기 컬럼은 섭씨 4도에서 3, 500G에서 1 시간, 45 분 동안 또는 잔류물 수준이 100 마이크로 리터가 될 때까지 일치합니다.
실린더를 통과하는 흐름을 제거하고 흐름을 폐기하십시오. 울트라 필트레이션 장치를 거꾸로 뒤집고 섭씨 4도에서 1000XG에서 2분 동안 원심분리합니다. 튜브를 섭씨 영하 80도 냉동고에 넣기 전에 콘의 잔류물을 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 0.22미크론 여과된 PBS로 샘플 부피를 150마이크로리터로 만듭니다.
개별 분획의 대표적인 웨스턴 블록은 CD9, CD63, 및 CD81의 강한 발현을 나타내었다. 1-4 위반 및 표현 위반이 거의 또는 전혀 없음 5-8. 어떤 분획에서도 GM130 또는 칼넥신의 발현이 관찰되지 않았다.
알부민은 분획 6 내지 8개로만 존재하였다. EV 및 단백질 분획을 농축하는 효과도 평가하였다. 세포 용해물에서 CD9 및 CD63의 발현이 관찰되었다.
3개의 CD 단백질 모두 대조군 및 튜니카마이신 처리된 샘플의 EV 분획에는 존재했지만 단백질 분획에는 존재하지 않았습니다. 종양 감수성 유전자 101은 세포 용해물에는 존재했지만 EV 또는 단백질 분획에는 존재하지 않았습니다. GM130 및 칼넥신은 세포 용해물에서만 관찰되었다.
엑소좀이 고갈된 세포 배양 배지의 웨스턴 블롯에서, EV 마커는 세포 용해물에는 존재했지만 배지 샘플에는 존재하지 않았다. 알부민 발현은 세포 용해물에서 단백질 분획 및 최소 발현에서 관찰되었다. TEM 관찰은 대조군 및 튜니카마이신 처리된 샘플의 EV 분획에서 구형 구조를 입증했습니다.
이들 구조는 어느 샘플 유형의 단백질 분획에서도 관찰되지 않았다. 나노입자 추적 분석은 대조군과 비교하여 EV 분획에서 대조군 및 처리된 분획의 입자 농도의 차이를 보여주며, 튜니카마이신 처리에서 약간 더 많은 입자가 존재하였다. 그러나 단백질 분획에서는 EV에 비해 더 적은 입자가 검출되었습니다.
제어 및 처리 조건에 대해 동일한 샘플 부피를 갖는 것이 중요하므로 다른 처리의 EV를 쉽게 비교할 수 있습니다. 조건 세포 배양 배지에서 EV를 분리한 후 단백질체학 RNA 시퀀싱 및 지질체학을 사용하여 소포의 단백질, RNA 및 지질 함량을 특성화할 수 있습니다.
