Отделение внеклеточных везикул от жидкостей, таких как среда клеточной культуры, может позволить исследователям охарактеризовать вестикулярный груз и исследовать их внутриклеточные механизмы связи. Этот метод позволяет обеспечить достаточное отделение EV и внеклеточных белков от условных сред клеточных культур, что является простым и удобным для пользователя. Для начала поместите PBS на водяную баню с температурой 37 градусов по Цельсию.
Наблюдают за контролем обработанных туникамицином колб клеточных культур под составным микроскопом с объективом 10 x и 100 x. Обратите внимание на любые различия между колбами. Извлеките среду из колбы и поместите ее в 50-миллилитровую трубку.
Затем центрифугируйте трубку при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и перенесите супернатант в новую трубку. Центрифугируйте трубку при 2000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супер натант в новую трубку и поместите трубку на лед.
Возьмите четыре 15 миллилитров три килодалтоны отсечных ультрафильтрационных установок и добавьте пять миллилитров PBS в каждую трубку. Загрунтуйте фильтры, центрифугируя агрегаты при 4000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После удаления PBS из блоков разделите супернатант из контрольных и обработанных состояний на две ультрафильтрационные установки, каждая из которых имеет приблизительно 12,5 миллилитров среды в каждой.
Центрифугируйте трубки при 4000 Г в течение одного часа 45 минут при четырех градусах Цельсия или до тех пор, пока концентрированная среда или ретентат в каждом блоке не сконцентрируется до 250 микролитров или менее. Перенесите ретентат из обоих блоков управления в маркированную микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра и из обработанных блоков в другую трубку. Измерьте общий объем ретентата в каждой микроцентрифужной трубке.
Если объем составляет менее 500 микролитров, добавьте 0,22 микронного фильтрованного PBS до тех пор, пока конечный объем не составит 500 микролитров. Поместите трубки в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов цельсия. Включите автоматический дробной коллектор или AFC.
Снимите столбец с четырех градусов цельсия и дайте колонке прогреться до комнатной температуры. Извлеките образцы ретентата из морозильной камеры при минус 80 градусах Цельсия и поместите их на лед для оттаивания, во время ожидания установите восемь маркированных 1,5 миллилитровых трубок в карусель AFC с крышками, обращенными внутрь. Вставьте столбец в AFC со штрих-кодом, обращенным к считывателю, и отрегулируйте настройки, чтобы собрать восемь фракций по 500 микролитров каждая и объем буфера по умолчанию.
Затем проверьте инструкции на экране, чтобы начать коллекцию. После хранения буфер полностью впитывается в верхнюю часть матрицы столбца. Начните промывку колонны, добавив в нее 15 миллилитров PBS.
Не добавляйте PBS слишком рано, так как это разбавит буфер хранилища и предотвратит адекватную промывку. Непосредственно перед тем, как все 15 миллилитров PBS будут поглощены матрицей, нажмите ok, чтобы остановить промывку и удалить любые остаточные PBS из верхней части матрицы колонны с помощью микропипетки. Не прикасайтесь к матрице.
Добавьте 500 микролитров образца в центр столбца и нажмите ok, чтобы начать запуск. После того, как образец будет полностью поглощен матрицей, сразу же добавьте восемь миллилитров PBS в колонку. AFC автоматически рассеивает объем пустоты в центре карусели, прежде чем собрать все восемь фракций по 500 микролитров каждая.
После пробега снимите фракции с карусели и поместите их на лед. Затем удалите объем пустоты из центра карусели. Затем добавьте 10 миллилитров PBS в колонку, чтобы промыть любой остаточный образец из колонны.
И как только раскаявшийся образец будет полностью промыт, добавьте в колонну 15 миллилитров PBS. Когда конечная PBS поглощается матрицей, добавьте 500 микролитров 0,5 молярного гидроксида натрия в центр матрицы колонны. Затем, когда гидроксид натрия всасывается, добавьте 30 миллилитров PBS в колонку и дайте ему промыться.
После того, как это сделано со всеми образцами, сохраните колонну для последующего использования, добавив в колонку 15 миллилитров 0,05% азида натрия. Оставьте примерно пять миллилитров азида натрия в верхней части матрицы колонки. Снимите колонну с AFC и прикрепите верхнюю и нижнюю крышки, прежде чем поместить колонну при четырех градусах Цельсия для хранения.
Постройте установку ультрафильтрации. Получите два миллилитра, три килодальтонных отсечных ультрафильтрационных блока на образец. Каждый блок состоит из трех частей, конуса, фильтра и потока через цилиндр.
Пометьте каждую деталь правильно. Добавьте один миллилитр PBS в порцию фильтра и колпачок с конусной частью. Центрифугируйте конус блока ультрафильтрации стороной вверх при 3 500 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и удалите отфильтрованный PBS из потока через цилиндр.
Переверните блок ультрафильтрации вверх дном и центрифугируйте в течение двух минут при 1000 G при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить оставшийся PBS. Объедините четыре 500 микролитров каждой фракции и добавьте их в блок ультрафильтрации. Затем колонны центрифуги совпадают в течение одного часа, 45 минут при 3, 500 Г при четырех градусах Цельсия или до тех пор, пока уровень ретентата не достигнет 100 микролитров.
Удалите поток через цилиндр и отбросьте поток через него. Переверните ультрафильтрационный блок вверх дном и центрифугируйте в течение двух минут при 1000 XG при четырех градусах Цельсия. Перенесите ретентат в конусе в трубку размером 1,5 миллилитра и сделайте объем образца до 150 микролитров с 0,22 микронной фильтрованной PBS перед помещением пробирок в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов цельсия.
Репрезентативный западный блок отдельных фракций показал сильную экспрессию CD9, CD63 и CD81. Нарушения от одного до четырех с небольшим количеством нарушений выражения или вообще без них от пяти до восьми. Экспрессия GM130 или кальнексина не наблюдалась ни в одной фракции.
Альбумин присутствовал только в фракциях от шести до восьми. Также оценивалась эффективность концентрации EV и белковых фракций. Экспрессия CD9 и CD63 наблюдалась в клеточных лизатах.
Все три белка CD присутствовали в EV-фракциях контрольных и обработанных туникамицином образцов, но не в белковых фракциях. Ген восприимчивости опухоли 101 присутствовал в клеточных лизатах, но не в EV или белковых фракциях. GM130 и кальнексин наблюдались только в клеточных лизатах.
В западном пятне экзосомной истощенной среды клеточной культуры маркеры EV присутствовали в лизатах клеток, но не в образцах среды. Экспрессия альбумина наблюдалась в белковых фракциях и минимальная экспрессия в клеточных лизатах. Наблюдения ТЕА продемонстрировали сферические структуры в контрольных фракциях EV и обработанных туникамицином образцах.
Эти структуры не наблюдались ни в одной из белковых фракций типа образца. Анализ отслеживания наночастиц выявляет различия в концентрациях частиц контрольной и обработанной фракций в фракциях EV по сравнению с контрольной, при обработке туникамицином присутствовало несколько больше частиц. Однако в белковых фракциях было обнаружено меньше частиц относительно EV.
Важно иметь одинаковый объем образца для контрольных и обработанных состояний, что позволяет легко сравнивать электромобили из разных методов лечения. После отделения EV от состояния среды клеточной культуры мы можем охарактеризовать содержание белка, РНК и липидов в везикулах с помощью протеомического секвенирования РНК и липидомики.
