Die Trennung extrazellulärer Vesikel von Flüssigkeiten wie Zustandszellkulturmedien kann es Forschern ermöglichen, vestikuläre Fracht zu charakterisieren und ihre intrazellulären Kommunikationsmechanismen zu erforschen. Diese Technik ermöglicht eine ausreichende Trennung von EVs und extrazellulären Proteinen aus konditionierten Zellkulturmedien, die einfach und benutzerfreundlich ist. Um zu beginnen, legen Sie PBS in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad.
Beobachten Sie die Kontroll- und Tunicamycin-behandelten Zellkulturkolben unter einem zusammengesetzten Mikroskop mit einer 10-fachen und 100-fach-Objektivlinse. Notieren Sie sich eventuelle Unterschiede zwischen den Flaschen. Das Medium aus dem Kolben nehmen und in ein 50-Milliliter-Röhrchen geben.
Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und übertragen Sie den Supernatant in ein neues Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Supernatant in eine neue Röhre und legen Sie die Röhre auf Eis.
Nehmen Sie vier 15 Milliliter drei Kilodalton Cutoff-Ultrafiltrationseinheiten und fügen Sie fünf Milliliter PBS zu jedem Röhrchen hinzu. Saugen Sie die Filter an, indem Sie die Einheiten bei 4.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem Entfernen von PBS aus den Einheiten teilen Sie den Überstand aus Kontroll- und behandelten Bedingungen in zwei Ultrafiltrationseinheiten mit jeweils etwa 12,5 Milliliter Medien auf.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4.000 G für eine Stunde 45 Minuten bei vier Grad Celsius oder bis das konzentrierte Medium oder Retentat in jeder Einheit auf 250 Mikroliter oder weniger konzentriert ist. Das Retentat von beiden Steuergeräten in ein markiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und von behandelten Einheiten in ein anderes Röhrchen überführen. Messen Sie das Gesamtvolumen des Retentats in jedem Mikrozentrifugenröhrchen.
Wenn das Volumen weniger als 500 Mikroliter beträgt, fügen Sie 0,22 Mikron gefiltertes PBS hinzu, bis das endgültige Volumen 500 Mikroliter beträgt. Legen Sie die Röhrchen in einen minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank. Schalten Sie den automatischen Fraktionssammler oder AFC ein.
Entfernen Sie die Säule von vier Grad Celsius und lassen Sie die Säule auf Raumtemperatur erwärmen. Nehmen Sie Retentatproben aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und legen Sie sie zum Auftauen auf Eis, während Sie warten, legen Sie acht beschriftete 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Deckeln nach innen in das AFC-Karussell. Fügen Sie die Spalte mit dem Barcode zum Lesegerät in den AFC ein und passen Sie die Einstellungen an, um acht Bruchteile von jeweils 500 Mikrolitern und das Puffervolumen auf die Standardeinstellung zu sammeln.
Überprüfen Sie dann die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sammlung zu starten. Danach wird der Speicherpuffer vollständig in den oberen Teil der Säulenmatrix absorbiert. Beginnen Sie mit dem Spülen der Säule, indem Sie der Säule 15 Milliliter PBS hinzufügen.
Fügen Sie PBS nicht zu früh hinzu, da dies den Speicherpuffer verdünnt und eine ausreichende Spülung verhindert. Kurz bevor alle 15 Milliliter PBS von der Matrix absorbiert werden, klicken Sie auf OK, um die Spülung zu stoppen und alle verbleibenden PBS von der Oberseite der Säulenmatrix mit einer Mikropipette zu entfernen. Berühren Sie die Matrix nicht.
Fügen Sie 500 Mikroliter Probe in die Mitte der Spalte hinzu und klicken Sie auf OK, um den Lauf zu starten. Nachdem die Probe vollständig in die Matrix aufgenommen wurde, fügen Sie sofort acht Milliliter PBS in die Säule ein. AFC vertreibt das Hohlraumvolumen automatisch in die Mitte des Karussells, bevor alle acht Fraktionen von jeweils 500 Mikrolitern gesammelt werden.
Entfernen Sie nach dem Lauf Fraktionen aus dem Karussell und legen Sie sie auf Eis. Entfernen Sie dann das Leerraumvolumen aus der Mitte des Karussells. Als nächstes fügen Sie der Säule 10 Milliliter PBS hinzu, um die Restprobe aus der Säule zu waschen.
Und sobald die reuige Probe vollständig gespült wurde, fügen Sie 15 Milliliter PBS in die Säule ein. Wenn das endgültige PBS von der Matrix absorbiert wird, fügen Sie 500 Mikroliter 0,5 molare Natriumhydroxid in die Mitte der Säulenmatrix hinzu. Dann, wenn das Natriumhydroxid absorbiert wird, fügen Sie 30 Milliliter PBS in die Säule und lassen Sie sie durchspülen.
Sobald alle Proben fertig sind, bewahren Sie die Säule für die spätere Verwendung auf, indem Sie der Säule 15 Milliliter 0,05% Natriumazid hinzufügen. Lassen Sie ungefähr fünf Milliliter Natriumazid auf der Oberseite der Säulenmatrix. Entfernen Sie die Säule aus dem AFC und bringen Sie die obere und untere Kappe an, bevor Sie die Säule zur Lagerung bei vier Grad Celsius platzieren.
Konstruieren Sie die Ultrafiltrationseinheit. Erhalten Sie zwei Milliliter, drei Kilodalton Cutoff-Ultrafiltrationseinheiten pro Probe. Jede Einheit besteht aus drei Teilen, Kegel, Filter und Durchflusszylinder.
Beschriften Sie jedes Teil richtig. Fügen Sie einen Milliliter PBS in den Filterteil und verschließen Sie ihn mit dem Kegelstück. Zentrifugieren Sie die Konusseite der Ultrafiltrationseinheit bei 3, 500 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie das gefilterte PBS aus dem Durchflusszylinder.
Drehen Sie die Ultrafiltrationseinheit auf den Kopf und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 1000 G bei vier Grad Celsius, um das restliche PBS zu entfernen. Kombinieren Sie vier 500 Mikroliter jeder Fraktion und fügen Sie sie der Ultrafiltrationseinheit hinzu. Dann fallen Zentrifugenkolonnen für eine Stunde, 45 Minuten bei 3.500 G bei vier Grad Celsius oder bis der Retentatspiegel bei 100 Mikrolitern liegt.
Entfernen Sie den Durchflusszylinder, und verwerfen Sie den Durchfluss. Drehen Sie die Ultrafiltrationseinheit auf den Kopf und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 1000 XG bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie das Retentat im Kegel in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und machen Sie das Probenvolumen auf 150 Mikroliter mit 0,22 Mikron gefiltertem PBS, bevor Sie die Röhrchen in minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank legen.
Ein repräsentativer westlicher Block einzelner Fraktionen zeigte eine starke Expression von CD9, CD63 und CD81. Verstöße eins bis vier mit wenig oder keinem Ausdruck Verstöße fünf bis acht. In keiner Fraktion wurde eine Expression von GM130 oder Calnexin beobachtet.
Albumin war nur in den Bruchteilen sechs bis acht vorhanden. Die Wirksamkeit der Konzentration der EV- und Proteinfraktionen wurde ebenfalls bewertet. Die Expression von CD9 und CD63 wurde in den Zelllysaten beobachtet.
Alle drei CD-Proteine waren in EV-Fraktionen von Kontroll- und Tunicamycin-behandelten Proben vorhanden, aber nicht in den Proteinfraktionen. Das Tumorempfindlichkeitsgen 101 war in Zelllysaten vorhanden, nicht jedoch in EV- oder Proteinfraktionen. GM130 und Calnexin wurden nur in den Zelllysaten beobachtet.
Im westlichen Blot von Exosomen-depletierten Zellkulturmedien waren die EV-Marker in den Zelllysaten vorhanden, aber nicht in den Medienproben. Die Albuminexpression wurde in den Proteinfraktionen und eine minimale Expression in den Zelllysaten beobachtet. TEM-Beobachtungen zeigten sphärische Strukturen in den EV-Fraktionen von Kontroll- und Tunicamycin-behandelten Proben.
Diese Strukturen wurden in beiden Proteinfraktionen des Probentyps nicht beobachtet. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigt Unterschiede in den Partikelkonzentrationen der Kontroll- und behandelten Fraktionen in EV-Fraktionen im Vergleich zur Kontrolle, etwas mehr Partikel waren in der Tunicamycin-Behandlung vorhanden. In den Proteinfraktionen wurden jedoch weniger Partikel im Vergleich zu EVs nachgewiesen.
Es ist wichtig, das gleiche Probenvolumen für die Kontroll- und behandelten Bedingungen zu haben, um einen einfachen Vergleich der EVs aus den verschiedenen Behandlungen zu ermöglichen. Nach der Trennung von EVs aus den Zustandszellkulturmedien können wir den Protein-, RNA- und Lipidgehalt der Vesikel mit Proteomics-RNA-Sequenzierung und Lipidomik charakterisieren.
